豬IgG Fc受體及其介導(dǎo)PRRSV抗體依賴增強(qiáng)作用研究.pdf

1、Fc受體（FcR）為特異親和免疫球蛋白（Ig）Fc片段的細(xì)胞表面分子，廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，具有許多重要的生理功能，是體液免疫與細(xì)胞免疫的聯(lián)系紐帶，在機(jī)體免疫調(diào)控中起關(guān)鍵作用。目前人和小鼠的三類IgG Fc受體（FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγⅢ）研究最為深入。本研究克隆和鑒定了豬IgG三類Fc受體；研究了PRRSV變異毒株和經(jīng)典毒株感染后活化性Fc受體和抑制性Fc受體的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)差異及與免疫抑制的關(guān)系；構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)豬FcγRⅡ的Mar

2、c-145細(xì)胞系，研究了該受體在介導(dǎo)PRRSV ADE中的重要作用。 用人CD64氨基酸序列檢索NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)（包括除人和老鼠以外的所有物種核苷酸序列）（tBLASTn），發(fā)現(xiàn)了6個(gè)豬的高同源overlapping序列，利用這些序列信息設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR從豬外周血白細(xì)胞中擴(kuò)增到了豬FcγRⅠ cDNA序列，命名為poFcγRⅠ。poFcγRⅠ ORF全長(zhǎng)1038 bp，編碼346氨基酸的糖蛋白。胞外區(qū)包括二個(gè)Ig

3、樣結(jié)構(gòu)，有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。poFcγR≧和人、牛與老鼠的FcγRⅠ在氨基酸水平上分別有79％、69％和57％的相似性。胞外環(huán)區(qū)相似性較高，分別為77％、74％和70％，這提示人、牛、豬、鼠的FcγRⅠ和IgG的結(jié)合域高度保守。隨后，RT-PCR檢測(cè)到了poFcγRⅠ mRNA在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞中表達(dá)量較高，在多形核細(xì)胞中也有表達(dá)，在淋巴細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)，和人與小鼠CD64的表達(dá)譜類似。將poFcγRⅠ ORF基因亞克隆到真核表達(dá)載體

4、pcDNA構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA/poFcγRⅠ，再用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，用玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)鑒定了poFcγRⅠ配體親和特性。 對(duì)豬IgG Fc受體的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)豬IgG Fc受體共由三類分子組成，即FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγⅢ，克隆了這二類受體cDNA，其中FcγRⅡ胞內(nèi)區(qū)有保守的ITIM基序，為抑制性受體；FcγRⅠ和FcγRⅢ胞內(nèi)區(qū)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)已知的信號(hào)傳導(dǎo)基序，通過(guò)γ鏈的ITAM基序進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因而這兩個(gè)受體為

5、活化性受體。發(fā)現(xiàn)FcγRⅡ至少存在兩個(gè)亞類，即FcγRⅡB1和FcγRⅡB2，F(xiàn)cγRⅡB1胞內(nèi)區(qū)有一插入序列，使胞內(nèi)區(qū)由47個(gè)氨基酸延長(zhǎng)到99個(gè)氨基酸。這兩個(gè)亞類胞內(nèi)區(qū)均存在ITIM基序，因此均為抑制性受體。 活化型受體和抑制型受體共表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，共同調(diào)節(jié)抗體對(duì)免疫細(xì)胞的活化作用。抗原抗體復(fù)合物和免疫細(xì)胞表面的活化型受體給合，能活化免疫效應(yīng)細(xì)胞，誘發(fā)多種免疫學(xué)效應(yīng)。抑制型受體的作用剛好相反，通過(guò)免疫復(fù)合物與抑制型受體交聯(lián)

6、，抑制活化受體介導(dǎo)的細(xì)胞活化。研究PRRSV感染后活化型和抑制型Fc受體的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)，對(duì)于揭示PRRSV感染引起的免疫抑制有重要意義。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)不同毒株P(guān)RRSV感染后豬體活化性和抑制性Fc受體的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后活化性受體FcγRⅠ和FcγRⅢ均迅速下調(diào)，而抑制性Fc受體FcγRⅡ感染后有輕微上調(diào)。PRRSV感染后機(jī)體能夠快速誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的特異性抗體，但感染后活化性Fc受體下調(diào)導(dǎo)致抗體和抗原抗體復(fù)合

7、物不能活化免疫效應(yīng)細(xì)胞，從而引起細(xì)胞免疫功能下降，這是PRRSV感染引起免疫抑制的分子基礎(chǔ)。 抗體依賴增強(qiáng)作用（ADE）是PRRS防控中遇劍的最大的難題之一。本研究將豬FcγRⅡ基因轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，通過(guò)G418連續(xù)篩選和克隆獲得了穩(wěn)定表達(dá)豬FcγRⅡ的Marc-145細(xì)胞系。用PRRSV BJ-4株與1：320稀釋的抗PRRSV IgG感染克隆化的Marc-145細(xì)胞系，在有抗體存在的情況下PRRSV感染收獲的病毒量明