ADAM17介導(dǎo)的豬源TNFα抑制PRRSV感染的研究.pdf

1、2006年，中國爆發(fā)了大規(guī)模的由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）引發(fā)的高熱病，呈現(xiàn)高熱、高發(fā)病率和高死亡率特征，嚴(yán)重危害豬只的健康，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有研究報(bào)道，PRRSV感染引發(fā)炎癥反應(yīng)時(shí)會(huì)伴隨大量TNFα的分泌產(chǎn)生。然而，迄今為止，有關(guān)豬源TNFα分泌機(jī)制的研究尚未有報(bào)道。此外，隨著對(duì)TNFα生物學(xué)活性的深入研究，TNFα的抗病毒作用也引起人們?cè)絹碓蕉嗟呐d趣和關(guān)注。
　　為探究TNFα對(duì)PRRSV

2、感染的影響，本研究針對(duì)HP-PRRSV HuN4毒株，首先采用ELISA方法檢測(cè)豬原代肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）在HP-PRRSV HuN4毒株感染后不同時(shí)間段TNFα的分泌情況，從而直接分析PRRSV感染對(duì)PAMs分泌TNFα的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAMs在PRRSV感染后分泌TNFα的水平顯著提高。為進(jìn)一步從細(xì)胞感染角度揭示TNFα在PRRSV感染中的作用，本研究選擇Marc-145細(xì)胞作為分析TNFα影響PRRSV感染的基礎(chǔ)細(xì)胞系，然后采

3、用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建能夠分泌 TNFα的 Marc-145細(xì)胞模型，接種病毒后，利用熒光定量 PCR、TCID50以及間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)病毒感染復(fù)制的情況，結(jié)果顯示 TNFα對(duì)PRRSV感染具有明顯的抑制作用。
　　去整合素-金屬蛋白酶17（ADAM17）是最先發(fā)現(xiàn)的剪切酶，可介導(dǎo)多種可溶性蛋白的產(chǎn)生，為進(jìn)一步探究豬源TNFα的分泌機(jī)制，展開了對(duì)ADAM17介導(dǎo)豬源TNFα分泌的研究。該研究首先在豬原代肺泡巨噬細(xì)胞PAMs上采用

4、ADAM17激活劑及抑制劑對(duì)其活性進(jìn)行修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在活化的ADAM17的PAMs細(xì)胞上清中TNFα分泌明顯上調(diào)，而經(jīng)ADAM17抑制劑預(yù)處理的PAMs幾乎無TNFα分泌。該結(jié)果初步揭示了ADAM17可介導(dǎo)PAMs中TNFα的分泌。為進(jìn)一步確定ADAM17介導(dǎo)豬源TNFα的分泌，本實(shí)驗(yàn)采用瞬轉(zhuǎn)的方法在體外構(gòu)建了能夠表達(dá)豬源TNFα的細(xì)胞模型（HEK293/TNFα），然后用ADAM17抑制劑及基因過表達(dá)技術(shù)對(duì) ADAM17活性進(jìn)行修飾。

5、結(jié)果顯示，在 ADAM17活性被抑制的細(xì)胞上清中TNFα分泌量顯著降低，而在ADAM17活性持續(xù)增強(qiáng)的細(xì)胞上清中TNFα分泌量明顯增加。最后，本研究采用shRNA基因敲除技術(shù)構(gòu)建了將ADAM17基因沉默的HEK293細(xì)胞，從而特異性分析ADAM17對(duì)豬源TNFα的剪切作用。結(jié)果顯示在ADAM17基因沉默的HEK293細(xì)胞中，幾乎無TNFα分泌。綜合以上，研究結(jié)果證明豬源TNFα的分泌是由ADAM17介導(dǎo)產(chǎn)生的。此外，本研究采用基因定點(diǎn)突