ADAM17在百草枯致肺纖維化中的初步研究.pdf

1、目的：構(gòu)建體外百草枯（paraquat，PQ）細(xì)胞纖維化模型，觀察PQ對(duì)II型肺泡上皮細(xì)胞（A549細(xì)胞）中解整合素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase-17，ADAM17)表達(dá)的影響和探討ADAM17在PQ中毒致肺纖維化中的作用。
　　方法：
　　1.建立細(xì)胞纖維化模型：1）體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為正常組、PQ組（50、100、200、400、

2、600、800、1000umol/L），分別作用12h、24h、36h、48h，應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，篩選出理想的PQ濃度（50、100、200umol/L）和作用時(shí)間（12h、24h、48h）。2）將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為正常組、PQ組（50、100、200umol/L），作用24h，應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定

3、各組纖維化標(biāo)志物I型膠原（type I collagen，Col I）和纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的表達(dá)，以確認(rèn)纖維化模型的成功。
　　2.觀察ADAM17在本細(xì)胞模型中的表達(dá)：將A549細(xì)胞分為正常組、PQ組（PQ濃度50、100、200umol/L），作用12h、24h、48h，采用(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫細(xì)胞化學(xué)（im

4、munocytochemistry，ICC）及蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）分別檢測(cè)ADAM17 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　3.ADAM17在PQ中毒致肺纖維化中的作用探討：使用ADAM17抑制劑（tumor necrosis factor-αprocessing inhibitor-1，TAPI-1），初步探討ADAM17在PQ中毒細(xì)胞模型中的作用；以TAPI-1進(jìn)行干預(yù)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為正常組、

5、PQ組（200umol/L）、PQ+TAPI-1組（PQ200umol/L+TAPI-120umol/L），作用時(shí)間24h，RT-PCR、ICC及Western blot分別檢測(cè)ADAM17 mRNA及蛋白的表達(dá)情況，以CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，ELISA測(cè)定各組Col I、FN的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.隨著PQ濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，A549細(xì)胞活性呈下降趨勢(shì)（P＜0.05），呈濃度和

6、時(shí)間依賴性。
　　2.倒置顯微鏡下正常的A549細(xì)胞融合呈鋪路石樣生長(zhǎng)，排列比較緊密，經(jīng)PQ誘導(dǎo)后細(xì)胞排列較松散，細(xì)胞間連接變疏松，部分細(xì)胞溶解、死亡。
　　3.ELISA結(jié)果顯示，隨PQ濃度增加，Col I和FN表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05），成功建立PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞纖維化模型。
　　4.百草枯細(xì)胞纖維化模型中有ADAM17的表達(dá)：1）ICC顯示,ADAM17在A549細(xì)胞胞漿表達(dá)，隨PQ濃度增加，黃色陽(yáng)性顆粒沉積越多。2）

7、RT-PCR和Western blot表明，隨著PQ濃度增加，ADAM17 mRNA及蛋白水平表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；隨著PQ作用時(shí)間延長(zhǎng)，ADAM17 mRNA及蛋白水平表達(dá)增加（P＜0.05），在24h達(dá)到高峰，呈一定時(shí)間依賴性。
　　5.TAPI-1抑制ADAM17的表達(dá)和纖維化：1）ICC顯示, PQ+TAPI-1組細(xì)胞質(zhì)中黃色陽(yáng)性顆粒的沉積較PQ組減少。2）RT-PCR及Western blot表明，PQ+TAPI

8、-1組較PQ組相比，ADAM17 mRNA及蛋白表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.05）。3）CCK-8結(jié)果提示PQ+TAPI-1組細(xì)胞活力較PQ組有所改善（P＜0.05）。4）顯微鏡下觀察 PQ+TAPI-1組細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞間隙介于正常組和PQ組之間，細(xì)胞溶解較PQ組減少。5）ELISA結(jié)果顯示，PQ+TAPI-1組較PQ組Col I和FN的表達(dá)下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.百草枯構(gòu)建體外A549細(xì)胞纖維化模型。