RNA干擾沉默Smad3基因?qū)Π俨菘葜滦∈蠓伍g質(zhì)纖維化的保護作用.pdf

1、百草枯(paraquat,PQ),又稱克無蹤、對草快,屬于有機雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑。化學名稱是1,1’-二甲基-4,4-’聯(lián)毗啶,分子式為C12 H14 N2·2Cl。自1962年起,百草枯作為除草劑應用于農(nóng)業(yè)并得到迅速推廣,目前在中國農(nóng)村應用非常廣泛。但人和動物攝入百草枯后,會表現(xiàn)出強烈的毒性。我國常可見到百草枯中毒病例,即使食入少量百草枯,也表現(xiàn)出極高死亡率,個別報道高達80％以上。
　　 百草枯可引起多臟器損傷,但以

2、肺損傷最為突出。肺損傷表現(xiàn)為肺水腫、炎癥細胞浸潤、肺泡出血、成纖維細胞增生和膠原沉積。百草枯中毒患者臨床表現(xiàn)分為兩個階段:早期患者在中毒數(shù)天內(nèi)死于急性呼吸窘迫綜合征和多臟器功能衰竭。大多數(shù)早期存活下來的患者將逐漸出現(xiàn)不可逆的肺間質(zhì)纖維化并在數(shù)周內(nèi)死亡。個別幸存的病人由于存在肺間質(zhì)纖維化,也嚴重影響其生存質(zhì)量。
　　 轉(zhuǎn)化生子因子-β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)可以誘導膠原合成和基質(zhì)

3、改變,在各種類型的肺間質(zhì)纖維化中都具有重要的作用,被稱為纖維化進程的“開關(guān)因子”。在百草枯中毒的早期,就可檢測到TGF-β1mRNA和蛋白表達增強。近幾年的研究表明,TGF-β1信號是通過Ⅰ、Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體進行傳導。激活的Ⅰ受體磷酸化下游的信號分子,受體激活型的Smads蛋白(Smad2和Smad3),它們將與Smad4結(jié)合,轉(zhuǎn)錄入核,調(diào)節(jié)TGF-β應答基因的轉(zhuǎn)錄,進而引起纖維化相關(guān)的改變。其中,Smad3基因的表達在肺纖維

4、化中起重要作用。敲除Smad3的小鼠對博來霉素誘導的肺間質(zhì)纖維化表現(xiàn)出極大的抵抗,提示抑制肺組織中Smad3基因表達對藥物性肺纖維化有治療作用。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種新的技術(shù)手段,能在體內(nèi)或體外特異性的抑制靶基因的表達。RNAi主要通過在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達,因此又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默。其作用主要是通過dsRNA被核酸酶切割成21-25nt的干涉性的小的RNA即siRNA,由si

5、RNA識別介導并靶向切割同源性的靶mRNA分子實現(xiàn)的。RNAi具有高效性和高度特異性等特點。目前發(fā)展的載體表達短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA),既避免了引起干擾素應答,又允許組織特異性的抑制基因表達,使RNAi更方便進行哺乳動物水平的實驗研究和基因水平的治療。腺病毒作為基因載體能感染絕大部分細胞,是體外進行基因沉默的有效載體,對肺組織中的上皮細胞和間質(zhì)細胞具有很好的轉(zhuǎn)染率。
　　 目的：
　　

6、 本實驗在百草枯致小鼠肺間質(zhì)纖維化模型基礎(chǔ)上,利用免疫組化的方法,分析從早期炎癥反應階段和纖維化進展期中TGF-β1和Smad3在肺組織中的表達和定位。并進一步通過重組腺病毒攜帶shRNA,沉默百草枯染毒小鼠肺組織中的Smad3基因,觀察其對肺間質(zhì)纖維化形成的保護作用。
　　 材料和方法：
　　 1、免疫組化研究TGF-β1和Smad3在百草枯致肺間質(zhì)纖維化早期過程中的表達和定位
　　 (1)百草枯致小鼠肺間質(zhì)

7、纖維化模型的建立
　　 雄性C57BL/6J小鼠,8-10w,18-22g,在相同條件下飼養(yǎng),恒溫恒濕,人工照明12h/d,24h自由進食水。百草枯溶液從小鼠腹腔(10mg/kg)注入。對照組腹腔注入等量生理鹽水。
　　 (2)標本的采集和免疫組化研究
　　 在實驗組不同時間點(2、5、7、14d)和對照組(7d)對小鼠進行處理。左肺葉用4％多聚甲醛固定,用于HE染色。免疫組織化學方法分析不同時間點TGF-β1和

8、Smad3在肺組織中的表達和定位。
　　 2、沉默小鼠Smaqd3基因的shRNA篩選和重組腺病毒的構(gòu)建
　　 (1)shRNA的制備和載體的構(gòu)建
　　 根據(jù)小鼠Smad3mRNA(GenBank Accession No NM_016769),編碼短發(fā)夾轉(zhuǎn)錄序列。委托武漢晶賽生物技術(shù)公司編碼短發(fā)夾RNAs合成進質(zhì)粒pGenesi11.1+GFP。通過細菌克隆對質(zhì)粒進行擴增,陽性的克隆被進一步通過測序鑒定。

9、>　　 (2)細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
　　 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染用小鼠L929成纖維細胞。分組為空白對照、負對照、轉(zhuǎn)染pGenesi11.1+GFP Smad3-1、pGenesi11.1+GFP Smad3-2、pGenesi11.1+GFP Smad3-3質(zhì)粒組。細胞在轉(zhuǎn)染后48和72h進行收集。收集后的細胞用流式細胞儀對陽性克隆進行分選。對細胞進行RNA提取和實時熒光PCR分析,并進行Western Blot檢測,篩選高效抑制Smad3表達

10、的shRNA。并將篩選出的shRNA合成進重組腺病毒。
　　 3、重組腺病毒感染動物實驗
　　 (1)動物實驗的分組和重組腺病毒的感染:
　　 在百草枯致小鼠肺問質(zhì)纖維化模型的基礎(chǔ)上,分組如下:小鼠染毒后2h氣管內(nèi)注入藥品(PBS組,50μlPBS緩沖液;非靶向重組腺病毒組,50μl含1×109pfu攜帶非靶向shRNA重組腺病毒懸液;靶向重組腺病毒組,50μl含1×109pfu的攜帶shRNA重組腺病毒懸液)。

11、每個時間點(0、2、7、14、28d)5只。
　　 (2)標本收集及檢測指標
　　 不同時間點對實驗小鼠進行處理。取左肺葉一塊4％多聚甲醛固定,用于HE染色。另取左肺組織30mg用于羥脯氨酸(HYP)測定。取右肺組織0.5克,放入高壓過的1.5毫升管中,放入低溫冰箱中保存(Real time PCR檢測Smad3、Ⅰ型前膠原、GAPDHmRNA表達)。在0、7d取一塊右肺(同上大小)置于EP管中,凍于-70℃(Weste

12、rn檢測細胞核中的Smad3蛋白)
　　 4、統(tǒng)計學分析
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計處理,計量資料以均數(shù)士標準差表示,兩組件均數(shù)比較采用t檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 免疫組化結(jié)果:對照組肺泡腔中的少量巨噬細胞可觀察到TGF-β1染色陽性。染毒后2d-7d時TGF-β1染色陽性主要見于浸潤的巨噬細胞和中性粒細胞的胞漿中。14

13、d時TGF-β1染色陽性也見于成纖維細胞灶中的成纖維細胞和肌成纖維細胞。細胞外的。TGF-β1陽性信號主要見于肺間質(zhì)和肺泡腔中。對照組Smad3陽性表達見于少量支氣管上皮細胞和肺泡腔中的巨噬細胞。在第2-7d,Smad3陽性表達見于浸潤中的巨噬細胞和一些Ⅱ型肺泡上皮細胞。Smad3陽性信號見于細胞核。第14d,除了可見細胞核Smad3陽性的巨噬細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞外,在成纖維細胞灶中,增生的成纖維細胞核中也可見到Smad3弱陽性表達<

14、br>　　 體外實驗中共設(shè)計了和合成了3個Smad3的shRNA序列,并將其合成進pGenesi11.1+GFP質(zhì)粒。3個Smad3 shRNA分別被轉(zhuǎn)染進L929成纖維細胞。以空白對照組作為基礎(chǔ),通過Real TimePCR和Western檢測不同shRNA抑制Smad3表達的效果。在轉(zhuǎn)染后48和72h,轉(zhuǎn)染組的Smad3的mRNA和蛋白表達顯著被抑制,而在空白對照和負對照組并沒有受到影響。在這些特異性的shRNA中,Smad3-s

15、hRNA3顯示出最高的抑制效率。因此,我們選擇這個shRNA表達質(zhì)粒進行下一步的重組腺病毒感染動物的實驗。
　　 PBS組、非靶向腺病毒組和靶向腺病毒組在小鼠染毒后第2d均出現(xiàn)Smad3mRNA表達下降,并達到最低值,隨后逐漸增加。靶向腺病毒與前兩組相比,第2、7、14d時表達顯著下降。小鼠在染毒后,出現(xiàn)了Smad3在肺組織細胞核中的聚集。在靶向腺病毒組中,細胞核中Smad3聚集情況顯著減輕。
　　 HE染色結(jié)果表明靶向

16、腺病毒組與PBS組和非靶向腺病毒組相比,在7d、14d成纖維細胞增生、膠原沉積等纖維化程度較輕。28d肺纖維化程度顯著輕于對照組,肺泡腔塌陷少見,成纖維細胞增生相對較少。
　　 在PBS組和非靶向腺病毒組,染毒后7d時Ⅰ型前膠原mRNA表達相近。但在靶向腺病毒組,Ⅰ型前膠原mRNA表達卻顯著減少,約為PBS組的1/3(P＜0.01)。
　　 在染毒后28d,羥脯氨酸的檢測靶向腺病毒組是573μg/mg,和前兩組相比顯著減