(TGF-β1)-Smad2-3-CTGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在百草枯致肺纖維化中的作用.pdf

1、目的：本研究擬通過建立體外人胚肺成纖維細(xì)胞模型(MRC-5)，運(yùn)用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)，觀察百草枯(PQ)染毒后TGF-β1-Smad2/3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)情況；探討結(jié)締組織生長因子(CTGF)作為高效靶基因在PQ致肺纖維化中的作用；最后應(yīng)用基因沉默技術(shù)(siRNA)抑制CTGF表達(dá)，以期為PQ中毒致肺纖維化的治療提供新線索。
　　方法：體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)
　　1.探索PQ對MRC-5細(xì)胞損害的劑量效應(yīng)關(guān)

2、系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。以終濃度為0、12.5、25、50、100、200、400μmol/L PQ染毒細(xì)胞24h，MTT法檢測細(xì)胞存活率，觀察不同濃度PQ對細(xì)胞的損傷程度；使用終濃度50μmol/L PQ處理細(xì)胞6、8、12、24、48、72h，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，觀察PQ在不同時(shí)間點(diǎn)對細(xì)胞的損傷程度。
　　2.觀察不同濃度PQ染毒MRC-5細(xì)胞后，TGF-β1及其受體的異常表達(dá)情況。將細(xì)胞分為正常對照組(control)、2

3、5μmol/L、50μmol/L、100μmol/L PQ染毒組，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測TGF-β1蛋白表達(dá)水平，運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot，WB)檢測TβRI/TβRII蛋白表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶連反應(yīng)(Real-time PCR,RT-PCR)分別檢測TGF-β1、TβRI、TβRIImRNA表達(dá)水平。
　　3.為了

4、觀察PQ染毒對TGF-β1/Smads/CTGF信號通路的影響，將MRC-5細(xì)胞分成六組：正常對照組(control)、25μmol/L PQ染毒組、50μmol/L PQ染毒組、100μmol/L PQ染毒組、TGF-β1陽性對照組、TGF-β1刺激組(100μmol/L PQ+50μmol/L TGF-β1)。WB檢測p-Smad2、p-Smad3、Smad7蛋白表達(dá)水平；WB檢測CTGF、COL-I、COL-III蛋白表達(dá)水平，R

5、T-PCR檢測CTGF、COL-I、COL-IIImRNA表達(dá)水平。
　　4.建立CTGF基因沉默細(xì)胞模型，探討CTGF-siRNA能否成為PQ中毒致肺纖維化治療的新靶點(diǎn)。將CTGF-siRNA表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞，通過RT-PCR和流式細(xì)胞儀檢測鑒定模型是否建立成功；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測CTGF-siRNA-MRC-5細(xì)胞侵襲遷移活性。將細(xì)胞分為對照組、MOCK組和siRNA組。運(yùn)用WB檢測MMP-2、MMP-9、TIMP

6、-1、COL-I，COL-III蛋白表達(dá)水平；RT-PCR檢測MMP-2、MMP-9、TIMP-1、COL-I，COL-IIImRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：(1)與對照組比較，MRC-5細(xì)胞存活率隨著PQ劑量和時(shí)間的增加明顯降低(P<0.05)，呈劑量和時(shí)間依賴性。(2)與對照組比較，PQ25、50、100μmol/L染毒能夠誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞TGF-β1、TβRI、TβRII蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；不同濃

7、度PQ染毒MRC-5細(xì)胞24h，能夠誘導(dǎo)p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；Smad7蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)；值得注意的是，給與細(xì)胞PQ＋TGF-β1共同刺激時(shí)p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)水平達(dá)到了最高，而Smad7表達(dá)水平達(dá)到了最低；不同濃度PQ染毒MRC-5細(xì)胞24h，能夠使得CTGF、COL-I、COL-III蛋白及mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05)，給與MRC-5細(xì)胞PQ＋T

8、GF-β1共同刺激時(shí)CTGF、COL-I、COL-III蛋白及mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高；(3)用脂質(zhì)體lipofectamine2000轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞，測定其轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90％以上，說明CTGF-siRNA細(xì)胞模型建立成功；(4)轉(zhuǎn)染組(siRNA組)細(xì)胞增殖和侵襲能力顯著低于空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(Mock組)與對照組(Control)；與Control組及Mock組比較，siRNA組TIMP-1、COL-I、COL-III蛋白及mRN