TGF-β1在百草枯中毒誘導(dǎo)肺纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景]
　　“肺纖維化”是“彌漫性間質(zhì)性肺疾病（間質(zhì)性肺疾?。┑暮喎Q，是一組慢性進(jìn)行性破壞性肺間質(zhì)疾病。病理特征:肺泡壁呈慢性炎癥和與肺間質(zhì)纖維化改變。其中臨床最常見為特發(fā)性肺纖維化患者，占所有肺纖維化的65％。影像學(xué)表現(xiàn):胸膜下肺組織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，或出現(xiàn)蜂窩狀改變，雙下肺表現(xiàn)明顯，可出現(xiàn)磨玻璃影改變[1]。關(guān)于肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，目前尚未完全闡明。既往有研究表明肺損傷后在肺泡上皮修復(fù)的過程中，出現(xiàn)了肺間質(zhì)細(xì)胞的遷移、增殖及活

2、化，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞灶的形成，引起細(xì)胞外基質(zhì)大量分泌并蓄積引起肺間質(zhì)增寬，以上過程為不可逆性破壞[2]。
　　肺纖維化作為呼吸系統(tǒng)四大病種之一，病因多種多樣，比如物理因素、感染性因素、血管性因素等。在臨床工作中，隨著農(nóng)藥百草枯的廣泛使用，百草枯中毒在臨床急癥中頻發(fā)，百草枯中毒導(dǎo)致肺纖維化患者逐漸增加。
　　百草枯(PQ)，目前應(yīng)用最廣的有機(jī)雜環(huán)類除草劑，商品名為克無蹤，化學(xué)成分為1，1'-二甲基-4，4'-聯(lián)吡啶二氯化物。臨床

3、中口服百草枯后經(jīng)胃腸道吸收率為5-15％，百草枯吸收后可分布于全身組織器官，由于肺泡上皮細(xì)胞的主動攝取功能，故肺組織中濃度最高，肺組織濃度可達(dá)到血液組織濃度的10-90倍，中毒患者1周內(nèi)主要表現(xiàn)以急性肺水腫為主，1周后可出現(xiàn)肺纖維化改變，并且逐漸加重，2-3周達(dá)到高峰，形成明顯纖維化。肺臟作為百草枯中毒的主要靶器官，是目前百草枯中毒死亡的主要原因。大量中毒患者多死于早期肺損傷所導(dǎo)致的急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，晚期死亡原因多為百草枯

4、中毒引起的肺纖維化[3]。
　　急性百草枯中毒(acute paraquat poisoning，APP)導(dǎo)致肺纖維化既往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn):急性百草枯中毒后百草枯于肺泡上皮細(xì)胞大量蓄積，引起肺泡上皮細(xì)胞損傷與間質(zhì)細(xì)胞增生，成為目前急性百草枯中毒肺纖維化研究熱點。以上發(fā)生過程中出現(xiàn)成上皮細(xì)胞數(shù)量降低，形態(tài)改變，纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，從而引起肺組織纖維化發(fā)生[4]。細(xì)胞因子(CK)網(wǎng)絡(luò)失衡學(xué)說在急性百草枯中毒發(fā)病機(jī)制中起重要作用，在眾多

5、細(xì)胞因子中，TGF-β1公認(rèn)為始動因子。研究發(fā)現(xiàn)，以百草枯刺激A549細(xì)胞，可觀察到百草枯上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化，以及TGF-β1含量明顯增高，證實TGF-β1可能是百草枯誘導(dǎo)肺纖維化過程中的關(guān)鍵因子[5]。在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白與間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白表達(dá)的含量變化[6-9]，可作為證實上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要依據(jù)。
　　本研究的第一部分:跟蹤急性百草枯中毒患者雙肺CT變化，篩選肺纖維化患者為研究對象，

6、按時間點留取血液標(biāo)本，檢測百草枯中毒患者血清中炎性因子TGF-β1的含量變化，分析肺纖維化與炎性因子變化的相關(guān)性。第二部分:選擇A549細(xì)胞作為研究對象，通過TGF-β1、百草枯分別刺激A549細(xì)胞制造EMT的細(xì)胞模型，討論TGF-β1與百草枯導(dǎo)致肺纖維化機(jī)制。第三部分:選擇小鼠為研究對象，通過給予小鼠鼻飼百草枯建立肺纖維化動物模型，從組織學(xué)及蛋白表達(dá)分子水平檢測TGF-β1在肺纖維化發(fā)病中的表達(dá)變化來預(yù)測可能的肺纖維化機(jī)制。
　

7、　目前為止，急性百草枯中毒仍無有效的治療方法，臨床死亡率居高不下，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，探索急性百草枯中毒機(jī)制，明確治療靶點，將為百草枯中毒臨床治療指引方向。
　　[實驗方法與研究內(nèi)容]
　　第一部分:急性百草枯中毒患者血液中炎癥指標(biāo)變化。
　　選取2015.01-2016.01因急性百草枯中毒就診于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院患者，服藥24小時內(nèi)，年齡18歲-60歲，每7天復(fù)查雙肺CT了解肺部影像學(xué)進(jìn)展情況，檢測3小時、5

8、1小時、147小時內(nèi)血漿中E-cadhern、α-SMA、TGF-β1濃度變化。
　　第二部分:細(xì)胞實驗研究百草枯與TGF-β1導(dǎo)致肺纖維化的作用及分子機(jī)制。
　　共設(shè)置四個實驗組:空白對照組、百草枯處理組、TGF-β1誘導(dǎo)組、百草枯+TGF-β1阻斷組。外源性TGF-β1組、百草枯溶液組、百草枯+ TGF-β1阻斷劑組，分別刺激A549細(xì)胞，觀察A549細(xì)胞形態(tài)變化，免疫熒光與Western Blotting檢測顯示細(xì)胞表

9、面上皮標(biāo)志性蛋E-Cadherin與間質(zhì)標(biāo)志性蛋白α-SMA表達(dá)情況。
　　第三部分:動物實驗研究TGF-β1在百草枯中毒導(dǎo)致小鼠肺纖維化發(fā)病中的作用及機(jī)制。
　　60只雄性小鼠隨機(jī)分為實驗動物組（P組）、生理鹽水對照組（N組）。P組實驗動物均給予百草枯80mg/kg，用生理鹽水稀釋至1ml后一次性灌胃染毒。N組采用生理鹽水80mg/kg灌胃，實驗日期以動物灌胃造模試驗當(dāng)天為實驗0天，實驗第1天、3天、7天、14天、21天分

10、別處死6只動物，血漿行ELISA檢查檢測E-cadhern、α-SMA、TGF-β1水平，HE染色觀察肺組織形態(tài)變化，電鏡觀察上皮細(xì)胞形態(tài)變化及膠原沉積現(xiàn)象，選取TGF-β1、上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白(E-cadherin)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白(a-SMA)作為檢測對象行免疫組化檢查。結(jié)果顯示:隨著中毒時間的延長，與N組比較，P組TGF-β1表達(dá)增高，證實TGF-β1在肺纖維化早期起促進(jìn)肺纖維化發(fā)展的作用。組織學(xué)檢查證實急性百草枯中毒后肺泡上

11、皮細(xì)胞形態(tài)改變，表達(dá)下降，間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)上升，膠原蛋白沉積，證實肺纖維化模型成功。
　　[實驗結(jié)果]
　　1.急性百草枯中毒患者肺部影像學(xué)改變與血漿中TGF-β1、E-cadhern、α-SMA含量。
　　研究表明急性百草枯中毒致肺纖維化患者與對照組比較，中毒3小時TGF-β1含量無明顯變化，51小時、147小時血漿中TGF-β1含量明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義。在中毒早期TGF-β1含量逐漸增高與雙肺CT肺纖維化進(jìn)程一致，說

12、明TGF-β1可能參與并促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)程。急性百草枯中毒患者血漿中E-Cadherin含量于3小時、51小時與對照組比較無明顯降低，第147小時比較明顯降低，說明隨著時間延長，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)降低。與此相反，α-平滑肌肌動蛋白含量于第3小時比較無明顯變化，51小時、147小時比較明顯增高，說明隨著時間延長，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白逐漸增多。
　　2.細(xì)胞實驗研究百草枯與TGF-β1導(dǎo)致肺纖維化的作用及分子機(jī)制。
　　研究表明

13、在A549細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入TGF-β1，百草枯，百草枯+TGF-β1阻斷劑。TGF-β1組可見A549細(xì)胞形態(tài)變化，由立方形或三角形轉(zhuǎn)變成長梭形，細(xì)胞呈索條狀松散分布，即細(xì)胞發(fā)生了EMT現(xiàn)象;百草枯組細(xì)胞同樣發(fā)生了EMT現(xiàn)象，但細(xì)胞形態(tài)變化不如TGF-β1誘導(dǎo)組顯著。百草枯+TGF-β1阻斷組細(xì)胞形態(tài)改變較百草枯組減輕。免疫熒光與Western Blotting檢測:TGF-β1組、百草枯組E-Cadherin表達(dá)減少，α-SMA表

14、達(dá)增加，百草枯+TGF-β1阻斷組變化較前兩組減輕。以上結(jié)果說明TGF-β1作為肺纖維化的始動因子可啟動肺纖維化進(jìn)程，百草枯可能通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1從而發(fā)生肺纖維化，TGF-β1阻斷組可抑制百草枯導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)展。
　　3.動物實驗研究TGF-β1在百草中毒導(dǎo)致誘導(dǎo)小鼠肺纖維化發(fā)病中的作用及機(jī)制。
　　(1)研究表明急性百草枯中毒小鼠血漿中TGF-β1含量于第1、3、7、14天明顯增高，21天比較無意義。急

15、性百草枯小鼠患者血漿中E-Cadherin含量于第14、21天時與對照組比較明顯降低，說明隨著時間延長，上皮細(xì)胞表達(dá)降低。α-平滑肌肌動蛋白含量于第7、14、21天比較明顯增高，說明隨著時間延長，間質(zhì)細(xì)胞逐漸增多。
　　(2)HE染色表現(xiàn)急性百草枯中毒小鼠肺泡間隔破壞，增寬，肺泡內(nèi)見滲出物與血細(xì)胞。
　　(3)電鏡觀察急性百草枯中毒小鼠肺泡上皮細(xì)胞破壞明顯，肺間質(zhì)明顯增寬，膠原表達(dá)增加。
　　(4)急性百草枯中毒小鼠肺

16、組織中羥脯胺酸含量較對照組明顯增高。
　　(5)免疫組化顯示隨著中毒時間延長急性百草枯中毒小鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)增高，E-Cadherin表達(dá)下降，α-SMA表達(dá)增高。
　　[結(jié)論]
　　通過急性百草枯中毒患者雙肺CT變化及給予小鼠百草枯灌胃造模證實急性百草枯中毒肺纖維化模型成立。急性百草枯中毒后可引起血漿及肺組織中E-Cadherin表達(dá)下降，α-SMA表達(dá)增多，肺組織中羥脯胺酸含量增加進(jìn)一步證實肺纖維化診斷。