基于Hippo信號(hào)通路的紅花黃色素治療百草枯中毒肺纖維化的研究.pdf

1、背景:百草枯(PQ)為一種速效觸殺滅生型季胺鹽類除草劑，其化學(xué)名為1-1'-二甲基-4-4聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽。我國(guó)既是百草枯的生產(chǎn)大國(guó)，又是百草枯的消費(fèi)大國(guó)。隨著百草枯的廣泛使用，百草枯中毒患者也日益增多。百草枯脂溶性強(qiáng)，易于人體吸收，且在血液中基本不與血漿蛋白結(jié)合，故進(jìn)入人體后可迅速分布于肺、肝、腎和肌肉等組織器官中。其中肺組織既是百草枯在人體的主要蓄積器官，也是百草枯致人體損傷的主要靶器官。在百草枯中毒早期可發(fā)生急性肺損傷，到了中晚期則

2、以肺纖維化為主要表現(xiàn)，典型百草枯中毒患者的肺也被稱為“百草枯”肺。近幾十年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)百草枯的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，也取得一些進(jìn)展，但對(duì)于百草枯中毒的具體發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，故百草枯中毒，尤其是中重度中毒患者死亡率極高，臨床尚無特效解毒藥及救治方法。因此有必要進(jìn)一步研究百草枯中毒的發(fā)病機(jī)制，尤其是在分子與基因水平的研究，為百草枯中毒的治療帶來突破性進(jìn)展。
　　20世紀(jì)90年代，有學(xué)者在對(duì)果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)一種新的信號(hào)通路即H

3、ippo信號(hào)通路，目前已證實(shí)該通路參與了細(xì)胞增殖、分化和凋亡，在腫瘤的發(fā)生過程中起著重要作用。隨著對(duì)Hippo通路研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)該通路與人類的其他疾病如主動(dòng)脈瘤、組織纖維化、病毒性肝炎等的發(fā)生密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)Hippo信號(hào)通路和TGF-β1信號(hào)通路在調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)方面存在著交互作用，而TGF-β1已被認(rèn)為是百草枯中毒中引起肺纖維化的關(guān)鍵因子。因此，Hippo信號(hào)通路可能在百草枯中毒致肺纖維化的發(fā)病過

4、程中起著重要作用。在本研究中我們首次通過觀察百草枯染毒大鼠肺組織內(nèi)MST、Yap、TGF-β1及Smads等細(xì)胞因子的變化情況，了解Hippo信號(hào)通路在百草枯中毒致肺纖維化中的作用，為深入開展百草枯中毒發(fā)病機(jī)制的研究開辟新的思路。
　　中藥紅花是一種具有活血化瘀作用的常用藥物，自漢代以來廣泛應(yīng)用于臨床。紅花黃色素為紅花的提取物，其中85％以上為羥基紅花黃色素A(HSYA)，臨床上常用于各種缺血性心腦血管疾病的治療，其安全性及有效性

5、已得到證實(shí)。近年來隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)紅花黃色素還具有抗血栓、抗氧化、抗炎、抗纖維化等多種藥理作用。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)紅花黃色素能抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠及大鼠肺纖維化，同時(shí)在臨床上使用紅花黃色素治療IPF也取得了一定的效果。目前臨床上對(duì)百草枯患者主要以大劑量糖皮質(zhì)激素作為基本的抗炎及抗纖維化治療手段，不僅效果尚不理想，而且副作用較大，因此發(fā)現(xiàn)新的且副作用較小的治療藥物具有重要意義。本研究中我使用紅花黃色素及TGF-β1抑制劑SB43154

6、2干預(yù)百草枯染毒大鼠，通過觀察其肺組織病理學(xué)與部分蛋白分子表達(dá)水平的變化為百草枯中毒的臨床治療研究探索新的方向，提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1、建立急性大鼠百草枯中毒肺纖維化模型，研究Hippo信號(hào)通路在其發(fā)病機(jī)制中的作用;2、從Hippo信號(hào)通路角度出發(fā)探索紅花黃色素及TGF-β1抑制劑SB431542治療百草枯肺纖維化的分子機(jī)制，為藥物的臨床使用提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　選取成年（6周）雄性W

7、ister大鼠255只，隨機(jī)分為6組，其中空白對(duì)照組、SY對(duì)照組及SB對(duì)照組各35只，染毒組、SY干預(yù)組及SB干預(yù)組各50只。染毒組、SY干預(yù)組及SB干預(yù)組以50mg/kg給予體積分?jǐn)?shù)為20％的百草枯原液加生理鹽水稀釋至1ml灌胃;空白對(duì)照組、SY對(duì)照組及SB對(duì)照組與其等量生理鹽水灌胃。SY干預(yù)組給予紅花黃色素50mg/kg，SB干預(yù)組給予SB431542100μg/kg，每日腹腔注射，其余各組給予等量生理鹽水每日腹腔注射，連續(xù)給藥四周

8、。各實(shí)驗(yàn)組于實(shí)驗(yàn)開始后3、7、14、21、28天各處死6只大鼠。留取大鼠血液ELISA法檢測(cè)血清TGF-β1濃度。留取大鼠肺組織分別使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肺組織MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF mRNA的表達(dá);免疫熒光檢測(cè)肺組織MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF蛋白的表達(dá)及定位;Western-blotting檢測(cè)肺組織MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF蛋白的表達(dá)。留取大鼠肺組織病理

9、切片行HE及Masson染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理改變，并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。留取大鼠肺組織透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)的變化情況。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)生存率，用Kaplan-Meier方法比較各組生存率。
　　結(jié)果:
　　1.血清TGF-β1水平
　　染毒組大鼠血清TGF-β1濃度自3天開始進(jìn)行性升高，14天達(dá)到高峰，其后緩慢下降，28天仍高于對(duì)照組。SY干預(yù)組和SB干預(yù)組與染毒組有相同變化趨勢(shì)，但TGF-β1升高程

10、度較染毒組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)?？瞻讓?duì)照組、SY對(duì)照組及SB對(duì)照組TGF-β1濃度變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　2.肺組織MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF蛋白表達(dá)情況
　　(1)MST染毒組MST的表達(dá)3天開始下降，7天下降到最低值，其后緩慢升高，至28天仍低于對(duì)照組。SY干預(yù)組和SB干預(yù)組與染毒組有相同變化趨勢(shì)，但其下降幅度要低于染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)?？瞻讓?duì)照

11、組、SY對(duì)照組及SB對(duì)照組MST的表達(dá)各組間及時(shí)間點(diǎn)無明顯變化(p＞0.05)。MST蛋白主要表達(dá)定位于肺組織細(xì)胞胞漿中，僅在處于最強(qiáng)表達(dá)時(shí)細(xì)胞核中出現(xiàn)極少量表達(dá)。
　　(2)TGF-β1和Smad3染毒組TGF-β1和Smad3的表達(dá)3天開始進(jìn)行性升高，14天達(dá)到高峰，其后緩慢下降，28天仍處于較高水平。SY干預(yù)組和SB干預(yù)組與染毒組有相同變化趨勢(shì)，但其升高程度較染毒組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。空白對(duì)照組、SY對(duì)照組

12、及SB對(duì)照組TGF-β1和Smad3的表達(dá)各組間及時(shí)間點(diǎn)無明顯變化(p＞0.05)。TGF-β1蛋白表達(dá)定位于肺組織細(xì)胞胞漿中; Smad3在各對(duì)照組主要表達(dá)定位于肺組織細(xì)胞胞漿中，染毒后Smad3表達(dá)部位由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核。
　　(3) Yap和CTGF染毒組Yap和CTGF的表達(dá)自3天起進(jìn)行性升高，28天達(dá)到最高峰。SY干預(yù)組和SB干預(yù)組與染毒組有相同變化趨勢(shì)，但其升高程度較染毒組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)?？瞻讓?duì)照組

13、、SY對(duì)照組及SB對(duì)照組Yap和CTGF的表達(dá)各組間及時(shí)間點(diǎn)無明顯變化(p＞0.05)。Yap在各對(duì)照組主要表達(dá)定位于肺組織細(xì)胞胞漿中，染毒后Yap表達(dá)部位由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核;CTGF蛋白表達(dá)定位于肺組織細(xì)胞胞漿中。
　　3.病理學(xué)變化
　　(1)光鏡觀察空白對(duì)照組、SY對(duì)照組及SB對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整，未見明顯異常。染毒組早期表現(xiàn)為急性肺泡炎，肺組織充血水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基本無纖維化表現(xiàn)。隨時(shí)間炎癥表現(xiàn)逐漸加重

14、，14天達(dá)到高峰，并開始出現(xiàn)纖維化表現(xiàn)。21至28天肺組織炎癥表現(xiàn)逐漸減輕，但纖維化持續(xù)進(jìn)展加重。SY干預(yù)組和SB干預(yù)組與染毒組有相同病理學(xué)變化趨勢(shì)，但炎癥及纖維化表現(xiàn)較染毒組減輕。
　　(2)病理學(xué)評(píng)分空白對(duì)照組、SY對(duì)照組及SB對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)肺組織病理學(xué)評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。染毒組、SY干預(yù)組及SB干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)肺組織病理學(xué)評(píng)分均明顯高于空白對(duì)照組(p＜0.05)。染毒組各時(shí)間點(diǎn)肺組織病理學(xué)評(píng)分高于SY干預(yù)組及SB

15、干預(yù)組(p＜0.05)。
　　(3)電鏡觀察空白對(duì)照組、SY對(duì)照組及SB對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)肺組織超微結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯損傷。染毒組早期表現(xiàn)為Ⅰ、Ⅱ肺泡上皮細(xì)胞變性，線粒體腫脹，染色質(zhì)邊集等細(xì)胞損傷表現(xiàn)，晚期出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增殖及膠原纖維過度增生等纖維化表現(xiàn)。SY干預(yù)組和SB干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)與染毒組有類似超微結(jié)構(gòu)改變，但細(xì)胞損傷及組織纖維化程度較輕。
　　4.各實(shí)驗(yàn)組生存率比較
　　空白對(duì)照組、SY對(duì)照組及SB對(duì)照組大鼠生存

16、率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)?？瞻讓?duì)照組大鼠生存率明顯高于染毒組、SY干預(yù)組及SB干預(yù)組(p＜0.05)。SY干預(yù)組及SB干預(yù)組大鼠生存率高于染毒組(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.急性百草枯中毒時(shí)Hippo信號(hào)通路可通過MST-Yap途徑被激活，并通過參與TGF-β1/Smad信號(hào)通路對(duì)CTGF表達(dá)調(diào)控促進(jìn)大鼠肺纖維化的發(fā)生。
　　2.紅花黃色素及TGF-β1抑制劑SB431542能通過干預(yù)Hippo信號(hào)通路