重組豬肺表面活性蛋白A在體外抑制PRRSV感染宿主細胞的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的妊娠母豬發(fā)熱流產(chǎn),仔豬與育肥豬呼吸障礙為特征的傳染病,是目前危害養(yǎng)豬業(yè)最為嚴重的傳染病之一,給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。國內(nèi)外學者已經(jīng)對PRRS進行了大量的研究,對其致病機理等方面有了深入的了解。
　　 PRRSV是RNA病毒,感染的主要途徑為呼吸道,其宿

2、主細胞為豬肺泡巨噬細胞(Porcine Alveolar macrophage,PAM),病毒在不同親代之間變異較大。由于沒有有效的疫苗控制病毒的感染,所以動物體的天然免疫系統(tǒng)對該病毒的抵御作用顯得異常重要。天然免疫系統(tǒng)不僅能及時清除外來的病毒,同時也可促進或激活機體的獲得性免疫系統(tǒng)。已有研究表明,SP-A分子中含有能夠識別病毒表面多糖分子的結構域,具有一定的抗病毒作用。所以在目前尚無有效的PRRS疫苗的情況下,通過研究SP-A抗PRR

3、SV感染宿主細胞的作用,從先天性免疫方面為抗PRRSV感染的研究提供了新的途徑。
　　 因此,為研究SP-A是否具有抗PRRSV感染宿主細胞的活性,我們制備了重組豬SP-A蛋白,并在體外進行了與PRRSV相互作用的研究。本實驗首先采用PCR方法從含有豬SP-A基因的質粒中擴增SP-A基因,并將其插入到含有人CD5信號肽序列的真核表達載體pcDNA3.1A-CD5中,構建成SP-A基因的真核分泌型表達載體pcDNA3.1-CD5-

4、SPA/MH。將重組表達載體通過磷酸鈣介導轉染HEK293T細胞進行瞬時表達,通過Western blot方法鑒定表達產(chǎn)物,采用Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和層析法從培養(yǎng)基中分離和純化重組SP-A蛋白,通過ELISA方法檢測SP-A蛋白與PRRSV的結合活性。將SP-A蛋白與PRRSV孵育,然后感染MARC-145細胞和豬肺泡巨噬細胞,感染72 h后測定病毒滴度,分析重組豬SP-A蛋白對PRRSV感染的抑制作用。
　　 結果表明構建

5、的真核表達載體能夠介導SP-A基因在HEK293T細胞中進行分泌表達;表達的重組豬SP-A蛋白能夠與PRRSV進行劑量依賴性結合;用重組豬SP-A蛋白與PRRSV進行孵育,然后感染MARC-145細胞和豬肺泡巨噬細胞,結果顯示SP-A處理的PRRSV感染細胞后的病變程度顯著低于對照組。感染72 h后,SP-A處理組的PRRSV在MARC-145細胞和PAM細胞的滴度顯著低于SP-A非處理組。綜上所述,可以得出以下結論:重組豬SP-A蛋白