肺表面活性蛋白B前肽proSP-B的重組表達(dá)及抗菌活性研究.pdf

1、proSP-B(Precursor Surfactant Protein B)是肺表面活性蛋白B的前肽，其作為一個(gè)前體蛋白，在形成和調(diào)節(jié)肺表面活性蛋白B的形成過程中發(fā)揮著極其重要的作用。由于proSP-B蛋白氨基酸序列的疏水性和其結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，研究學(xué)者將其歸為鞘脂激活蛋白樣蛋白(Saposin-Like Proteins,SAPLIPs)超家族的一員，SAPLIPs家族成員作為一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的蛋白族群，具有非常廣譜的生物學(xué)功能，而抗菌

2、活性是其最為重要的功能之一。而近幾年來(lái)，隨著抗生素在食品及醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的濫用及不合理使用,引起了耐藥、泛耐藥、交叉耐藥，甚至是超級(jí)細(xì)菌的不斷出現(xiàn),使得抗感染問題變的越來(lái)越嚴(yán)峻，而抗生素的毒副作用也使得人類的健康及生命安全面臨極大威脅。因此，開發(fā)一類新的高效，低毒，具有新的抗菌作用機(jī)制的藥物迫在眉睫。抗菌肽作為一類由生物體自身生理活動(dòng)產(chǎn)生的，具有廣譜抗菌活性的小分子物質(zhì)，日漸成為替代傳統(tǒng)抗生素的一類新型抗菌藥物。
　　在本實(shí)驗(yàn)研究中

3、，我們利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了pGEX4T-1-proSP-B原核表達(dá)載體，并用IPTG成功誘導(dǎo)表達(dá)并純化出proSP-B蛋白，分析proSP-B蛋白在CCL149細(xì)胞中的定位和毒性作用，為proSP-B蛋白的抗菌作用及作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)；接著濾紙片法檢測(cè)proS-B蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抗菌活性，再以金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌，考察蛋白的抗菌作用機(jī)理，為

4、開發(fā)新型的抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。
　　目的：本課題旨在研究通過基因工程技術(shù)構(gòu)建、表達(dá)、純化獲得proSP-B重組蛋白，分析其毒性和抗菌活性及抗菌機(jī)制，為將proSP-B開發(fā)成一種新型的抗菌藥物奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　（1）構(gòu)建pGEX4T-1-proSP-B原核表達(dá)載體，分析proSP-B融合表達(dá)特性。proSP-B的氨基酸序列疏水性較強(qiáng)，較難通過化學(xué)合成的方式獲得，實(shí)驗(yàn)中通過基因工程的方法將目的基因proS

5、P-B構(gòu)建到pGEX4T-1質(zhì)粒上，然后利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE、Western Blot檢測(cè)proSP-B的表達(dá)，并純化獲得proSP-B蛋白。
　　（2）考察proSP-B蛋白的細(xì)胞熒光定位及細(xì)胞毒性。構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N2-proSP-B，然后將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到CCL149細(xì)胞中，利用載體上攜帶
　　的GFP基因，結(jié)合DAPI核染與DiI細(xì)胞膜染色，分析proSP-B在細(xì)胞中的定位。將CCL1

6、49細(xì)胞與proSP-B蛋白共孵育考察proSP-B蛋白的細(xì)胞毒性。
　?。?）proSP-B蛋白的抗菌活性研究。培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，然后用濾紙片擴(kuò)散法考察proSP-B蛋白的抗菌活性及抗菌譜。
　?。?）proSP-B蛋白抗菌機(jī)理研究。選用金黃色葡萄球菌作為考察試驗(yàn)菌，利用碘化丙啶（PI）染色法和乳酸脫氫酶（LDH）酶活測(cè)定的方法研究

7、分析proSP-B蛋白的抗菌機(jī)理。
　　結(jié)果：
　　（1）成功構(gòu)建了proSP-B原核表達(dá)載體，并采用在延長(zhǎng)表達(dá)時(shí)間的方法，成功促進(jìn)重組proSP-B蛋白的可溶性表達(dá)，并純化了proSP-B蛋白，應(yīng)用BCA法測(cè)定其蛋白濃度為1 mg/mL。
　?。?）利用分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了融合表達(dá)載體pEGFP-N2-proSPB，發(fā)現(xiàn)GFP-proSP-B表達(dá)的綠色熒光蛋白主要定位在CCL149細(xì)胞的細(xì)胞膜上，而單獨(dú)表達(dá)GFP

8、的綠色熒光則分布在CCL149細(xì)胞的細(xì)胞胞質(zhì)中，說(shuō)明proSP-B能在CCL149細(xì)胞中特異性表達(dá)，并定位在細(xì)胞膜上而發(fā)揮其膜結(jié)合性功能。
　?。?）利用蛋白與細(xì)胞共培養(yǎng)的方式確定了proSP-B蛋白的細(xì)胞毒性，其IC50約為1595μg/mL，根據(jù)細(xì)胞毒性分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)初步確定proSP-B蛋白的細(xì)胞毒性是低毒的。
　?。?）通過濾紙片法成功測(cè)定了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、耐甲氧西林金

9、黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌對(duì)proSP-B蛋白的敏感性，并分別計(jì)算出其MIC值。發(fā)現(xiàn)proSP-B蛋白對(duì)細(xì)菌、真菌均具有一定的抑制作用，且對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的作用大于革蘭氏陰性菌，對(duì)細(xì)菌的作用大于真菌。
　?。?）以金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用PI熒光染色及LDH酶活法初步測(cè)定分析proSP-B蛋白的抗菌機(jī)理，結(jié)合proSP-B的細(xì)胞熒光定位，我們初步得出proSP-B發(fā)揮其抗菌活性的作用機(jī)理是proSP-B蛋白作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，