豬肺免疫防御相關(guān)基因—肺表面活性蛋白A的研究.pdf

1、豬呼吸系統(tǒng)疾病(PRD)已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)疾病，肺免疫防御相關(guān)基因的研究和挖掘?qū)τ趶倪z傳本質(zhì)上提高豬對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的抗性具有重要意義。 本文利用比較基因組學(xué)方法，以肺免疫防御相關(guān)基因—豬肺表面活性蛋白A(SP-A)作為豬呼吸系統(tǒng)免疫防御功能的候選基因，開展了豬肺表面活性蛋白A序列及其多態(tài)性、mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)含量變化的系列研究，取得了以下結(jié)果： ①采用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得了長(zhǎng)度為1910bp的豬SP-

2、A完整cDNA序列，此序列包含了編碼248個(gè)氨基酸的長(zhǎng)為747bp的完整開放閱讀框。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，豬SP-A的N端有20個(gè)殘基的信號(hào)肽，從N端到C端依次為4個(gè)結(jié)構(gòu)域：短的N-端區(qū)、膠原樣區(qū)域、莖區(qū)和碳水化合物識(shí)別區(qū)域。然后又用比較基因組學(xué)方法和引物步移法獲得了長(zhǎng)度為4229bp的豬SP-ADNA全序列，它由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。 ②以同一時(shí)期飼養(yǎng)在相同條件下的引進(jìn)品種大白豬361頭、培育品種松遼黑豬132頭為試驗(yàn)群1

3、，采用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)到33個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)，其中有5個(gè)SNPs位于外顯子上，3個(gè)為同義突變，2個(gè)為錯(cuò)義突變；這2個(gè)錯(cuò)義突變位于豬SP-A的碳水化合物識(shí)別區(qū)域，分別造成了丙氨酸變異為蘇氨酸、苯丙氨酸變異為酪氨酸。這些SNPs位點(diǎn)呈完全連鎖不平衡狀態(tài)，組成了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三種單體型。經(jīng)x2檢驗(yàn)表明，在大白豬試驗(yàn)群中，SP-A的基因頻率和基因型頻率都達(dá)到了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)；但是在松遼黑

4、豬試驗(yàn)群中，SP-A的基因頻率和基因型頻率都未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.01)。目前，兩個(gè)品種豬的SP-A基因都處于中度多態(tài)。 在品種內(nèi)，不同性別SP-A單體型頻率分布差異不顯著(P>0.05)。在大白豬中，SP-AⅡ單體型豬的PRD發(fā)病率最高，達(dá)33.67％，并且不同SP-A基因單體型大白豬PRD發(fā)病率差異極顯著(P<0.01)；在松遼黑豬中，也是SP-AⅡ單體型豬的PRD發(fā)病率最高，為10.53％，不

5、同SP-A基因單體型松遼黑豬的PRD發(fā)病率差異顯著(P<0.05)；表明在大白豬和松遼黑豬中，單體型與PRD發(fā)病率之間存在一定的關(guān)聯(lián)度。其中SP-A基因I單體型為抗PRD單體型，推測(cè)以SP-AI單體型豬具有較強(qiáng)的肺免疫防御功能。 ③通過(guò)以0.05ml/kg體重，少量分次，耳靜脈注射油酸成功建立了豬油酸—急性肺損傷模型，為進(jìn)一步開展有關(guān)豬肺損傷以及肺免疫防御相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。 ④以包含SP-A基因Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ單體型共54頭

6、仔豬建立試驗(yàn)群2，在仔豬斷奶穩(wěn)定后50±1日齡建立油酸—急性肺損傷模型。以肺含水量的變化作為反映肺損傷程度的指標(biāo)，分別采用熒光定量PCR和westernblot技術(shù)對(duì)肺組織中SP-AmRNA表達(dá)量和支氣管—肺泡灌洗液(BALF)中SP-A蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)與分析，發(fā)現(xiàn)：在1h時(shí)相點(diǎn)伴隨肺含水量的增加，SP-AmRNA表達(dá)量和SP-A蛋白含量均下降；在3h時(shí)相點(diǎn)伴隨肺含水量增加至最高(3個(gè)時(shí)相點(diǎn)中相比較)，SP-AmRNA表達(dá)量和SP-A蛋

7、白含量也降至三個(gè)時(shí)相點(diǎn)的最低水平；與1h時(shí)相點(diǎn)相比較，在6h時(shí)相點(diǎn)伴隨肺含水量的下降，SP-AmRNA表達(dá)量和SP-A蛋白含量分別極顯著上升(P<0.01)和顯著上升(p<0.05)。另外，與Ⅱ和Ⅲ單體型相比較，各時(shí)相點(diǎn)SP-AI單體型豬的肺含水量較對(duì)照組的升高幅度要??；BALF中SP-A蛋白含量較高，更接近于對(duì)照組水平；1h和3h時(shí)相點(diǎn)SP-AI單體型豬肺組織中的SP-AmRNA表達(dá)量也較高，也更接近于對(duì)照組水平，并且在6h時(shí)相點(diǎn)SP

8、-AI單體型豬的SP-AmRNA表達(dá)量顯著高于Ⅱ和Ⅲ單體型。上述結(jié)果表明，肺組織中SP-AmRNA表達(dá)量、BALF中SP-A蛋白含量與肺含水量即肺損傷程度的變化趨勢(shì)恰好相反；在同時(shí)受到病原致?lián)p傷的情況下，SP-AI單體型豬的SP-A水平會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)而有利于盡快緩解病原對(duì)肺的損傷，因此，推測(cè)SP-AI單體型豬具有較高的應(yīng)對(duì)病原損傷肺的能力。 以上結(jié)果表明，豬SP-A同人、小鼠等的SP-A一樣，也具有肺免疫防御功能；不同SP-

9、A單體型與PRD發(fā)病率之間存在一定關(guān)聯(lián)性，其中又以SP-AI單體型的豬具有較強(qiáng)的肺免疫防御能力，能夠使外來(lái)因素對(duì)肺臟的損傷程度降至最低，損傷時(shí)間降至最短，因而也降低了豬只由于長(zhǎng)時(shí)間處于致病原損傷狀態(tài)下而引起繼發(fā)感染的可能，具有較低的PRD發(fā)病率。 本研究結(jié)果首次較全面地揭示了豬SP-A的肺免疫防御功能，同時(shí)也為判斷發(fā)生PRD時(shí)豬只肺損傷的程度，為PRD的臨床診斷以及防治PRD新型藥物的研發(fā)和選擇肺免疫防御功能強(qiáng)的種豬個(gè)體奠定了一