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1、Fc受體(FcR)為特異親和免疫球蛋白(Ig) Fc片段的細(xì)胞表面分子,廣泛表達(dá)于免疫輔助細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞,具有許多重要的生理功能,是體液免疫與細(xì)胞免疫的聯(lián)系紐帶,在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。抗體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可通過(guò)激活型和抑制型FcR進(jìn)行調(diào)節(jié),因此FcR為治療過(guò)敏和自身免疫性疾病提供了理想的藥物靶標(biāo)。為深入研究Fc受體的結(jié)構(gòu)與功能及IgG與FcγR的相互作用,本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建了牛FcγR(FcγRⅡ,F(xiàn)cγRⅢ)原核表達(dá)載體和
2、真核表達(dá)載體,分別在大腸桿菌和COS—7細(xì)胞上進(jìn)行了表達(dá);分離純化了牛IgG1、IgG2,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了FcγR—IgG結(jié)合區(qū)域的鑒定及其與IgG亞類結(jié)合特異性的功能實(shí)驗(yàn)。 牛IgG Fc受體Ⅱ(boFcγRⅡ與入FcyRⅡ(CD32)同源,胞外區(qū)含有2個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域,遠(yuǎn)膜端(membrane distal)為第一結(jié)構(gòu)域(extracellular domain1,EC1),近膜端(membrane proximal)為第
3、二結(jié)構(gòu)域(EC2)。boFcγRⅡ?yàn)榕gG的低親和力受體,特異親和牛IgG1但不結(jié)合牛IgG2。將boFcγRⅡ胞外區(qū)cDNA亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a T7啟動(dòng)子下游,在E coli BL21(DE3)中高效表達(dá)了boFcγRⅡ,SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果表明,boFcγRⅡ表達(dá)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中主要以不溶性包涵體形式存在。為獲得功能性boFcγRⅡ蛋白,以鎳螯合親和層析為基礎(chǔ)建立柱內(nèi)復(fù)性技術(shù),boF
4、cγRⅡ變性蛋白通過(guò)其兩端的His-tag標(biāo)簽結(jié)合于鎳螯合層析柱,并在線性降低的尿素濃度梯度復(fù)性溶液中逐漸復(fù)性,通過(guò)加入氧化型和還原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)在2mol/L尿素濃度引入氧化還原環(huán)境,顯著提高功能性boFcγRⅡ的回收率。Dot-blot顯示boFcγRⅡ復(fù)性蛋白具有一定的生物活性,可特異結(jié)合牛IgG1。將boFcγRⅡ胞外區(qū)2個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域cDNA分區(qū)段亞克隆到原核表達(dá)載體pET-43.1a,經(jīng)IPTG在16℃過(guò)夜誘
5、導(dǎo),獲得了可溶性boFcγRⅡ EC1、boFcγRⅡ EC2表達(dá)蛋白,Dot-blot分析表明boFcγRⅡ EC2是與boIgG1結(jié)合的主要功能區(qū)域,而boFcγRⅡ EC1與boIgG1的結(jié)合則相對(duì)較弱。 牛IgG Fc受體Ⅲ(boFcγRⅢ)與人FcγRⅢ(CD16)同源,胞外區(qū)含有2個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域,也是牛IgG的低親和力受體。利用融合PCR技術(shù),將兩個(gè)低親合力受體boFcγRⅢ的胞外區(qū)和boFcγRⅡ的跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)
6、拼接產(chǎn)生一嵌合分子FcγRⅢ/Ⅱ。將FcγRⅢ/Ⅱ、boFcγRⅢ和boFcRγ-chain編碼區(qū)cDNA分別亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3,在COS-7細(xì)胞表面表達(dá)受體分子,通過(guò)玫瑰花環(huán)試驗(yàn)測(cè)定boFcγRⅢ的配體特異性,結(jié)果顯示,boFcγRⅢ和boFcRγ-chain質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,boFcγRⅢ/Ⅱ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞與IgG1紅細(xì)胞復(fù)合物形成明顯的玫瑰花環(huán),但未發(fā)現(xiàn)IgG2-RBC結(jié)合。提示boFcγRⅢ特異親和牛IgG1而不
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