牛IgG Fc受體線性配體結合表位鑒定.pdf

1、Fc受體(FcR)為特異親和免疫球蛋白(Ig)Fc片段的細胞表面分子，廣泛表達于免疫輔助細胞和效應細胞，具有許多重要的生理功能，是體液免疫與細胞免疫的聯(lián)系紐帶，在機體免疫調(diào)節(jié)中起關鍵作用?？贵w介導的炎性反應可通過激活型和抑制型FcR進行調(diào)節(jié)，因此FcR是治療過敏和自身免疫性疾病理想的藥物靶標。本研究利用化學合成多肽鑒定了牛IgGFc受體(FcγR)的線性配體結合表位，并分析了結合牛IgG的關鍵氨基酸殘基，是首次開展FcR線性配體結合表位

2、的探索研究，對深入了解FcγR-IgG相互作用的分子基礎有重要意義，為FcR靶標藥物的分子設計提供新的思路。 牛IgG2Fc受體(boFcγ2R)是一類新型的FcγR，與人IgAFc受體(huFcαRⅠ)同源，胞外區(qū)含有2個Ig樣結構域，通過遠膜端結構域(EC1)與牛IgG2特異結合。為在細胞表面表達受體分子，將boFcγ2R編碼區(qū)cDNA亞克隆到真核表達載體pcDNA3，轉(zhuǎn)染COS-7細胞，通過G418抗性篩選和連續(xù)克隆化，獲

3、得了穩(wěn)定表達boFcγ2R的轉(zhuǎn)染細胞株，牛IgG2致敏雞紅細胞(IgG2-RBC)的玫瑰花環(huán)形成率達90％左右，為boFcγ2R的功能研究提供了良好的技術平臺。將boFcγ2R胞外區(qū)cDNA亞克隆到原核表達載體pET-28a，在大腸桿菌中高效表達了boFcγ2R胞外區(qū)，以快速稀釋復性方法從包涵體變性蛋白中回收了具有良好結合活性的boFcγ2R重組蛋白。為鑒定boFcγ2R的線性配體結合表位，在EC1結構域設計合成boFcγ2R多肽，偶聯(lián)

4、于載體蛋白BSA；以Dot-blot檢測偶聯(lián)多肽與牛IgG2的結合，并對陽性多肽進行進一步缺失和突變分析。boFcγ2R的82-85位多肽FIGV具有特異結合牛IgG2的能力，為最短的IgG2有效結合多肽，表明boFcγ2R上存在牛IgG2的線性結合表位，位于受體EC1結構域的F-G環(huán)；多肽突變分析表明，boFcγ2R線性配體結合表位的Phe82、Ile83和Val85是結合牛IgG2的關鍵氨基酸殘基。含有boFcγ2R線性配體結合表位

5、的偶聯(lián)多肽FIGVNW不僅有效抑制牛IgG2與可溶性boFcγ2R的結合，而且對boFcγ2R轉(zhuǎn)染細胞表面的IgG2-RBC玫瑰花環(huán)形成也具有良好的抑制功效，表明該配體結合表位多肽具有調(diào)節(jié)牛IgG2與細胞表面boFcγ2R結合的能力，可用于FcR靶標藥物的研究開發(fā)。 牛IgGFc受體Ⅰ(boFcγRⅠ)與人FcγRⅠ(CD64)同源，為牛IgG的高親和力受體，胞外區(qū)含有3個Ig樣結構域，能高親和力結合牛IgG單體。將boFcγR

6、Ⅰ編碼區(qū)cDNA亞克隆到表達載體pcDNA3，在COS-7細胞表面表達受體分子，通過玫瑰花環(huán)試驗測定boFcγRⅠ的配體特異性，IgG1-RBC在boFcγRⅠ轉(zhuǎn)染細胞上形成明顯的玫瑰花環(huán)，但未發(fā)現(xiàn)IgG2-RBC結合，提示boFcγRⅠ特異親和牛IgG1而不結合牛IgG2。將boFcγRⅠ胞外區(qū)cDNA亞克隆到原核表達載體pGEX-6P-1，在大腸桿菌BL21中表達了boFcγRⅠ胞外區(qū)，但未能從包涵體中有效復性boFcγRⅠ重組蛋白

7、。為鑒定boFcγRⅠ的線性配體結合表位，在EC2結構域設計合成boFcγRⅠ多肽，Dot-blot結果顯示boFcγRⅠ的142-149位多肽TNLSHNGI是特異結合牛IgG1的最短有效多肽，為boFcγRⅠ的線性配體結合表位，位于受體EC2結構域E-F環(huán)；多肽突變分析表明，boFcγRⅠ線性配體結合表位的Thr142、Asn143、Leu144、Gly148和Ile149是結合牛IgG1的關鍵氨基酸殘基。 牛IgGFc受體

8、Ⅱ(boFcγRⅡ)與人FcγRⅡ(CD32)同源，胞外區(qū)含有2個Ig樣結構域，為牛IgG的低親和力受體，特異親和牛IgG1但不結合牛IgG2。為在細胞表面表達受體分子，將boFcγRⅡ編碼區(qū)cDNA亞克隆到表達載體pcDNA3，轉(zhuǎn)染COS-7細胞，通過G418抗性篩選和連續(xù)克隆化，獲得了在COS-7細胞表面穩(wěn)定表達受體分子的boFcγRⅡ轉(zhuǎn)染細胞株，其IgG1-RBC玫瑰花環(huán)形成率達90％左右，為boFcγRⅡ的功能研究提供了良好的技

9、術平臺。將boFcγRⅡ胞外區(qū)cDNA亞克隆到表達載體pcDNA3，轉(zhuǎn)染NS0細胞，利用G418抗性細胞誘生小鼠腹水，以鎳螯合層析純化boFcγRⅡ分泌蛋白，該重組蛋白特異結合牛IgG1。為鑒定boFcγRⅡ的線性配體結合表位，在EC2結構域設計合成boFcγRⅡ多肽，Dot-blot分析表明boFcγRⅡ的122-131位多肽FYQDRKSKIF是特異結合牛IgG1的最短有效多肽，為boFcγRⅡ的線性配體結合表位，位于受體EC2結構

10、域C-C'環(huán)；多肽突變結果顯示，以Ala置換Phe122、Tyr123、Arg126、Lys127、Ser128、Lys129或Phe131均導致boFcγRⅡ線性配體結合表位多肽喪失結合牛IgG1活性，提示boFcγRⅡ線性配體結合表位的上述氨基酸殘基為結合牛IgG1的所必需。 牛IgGFc受體Ⅲ(boFcγRⅢ)與人FcγRⅢ(CD16)同源，胞外區(qū)含有2個Ig樣結構域，也是牛IgG的低親和力受體。為鑒定boFcγRⅢ的線性