貉IgG交叉免疫原性及Fc多肽功能活性研究.pdf

1、IgG作為連接先天性免疫與獲得性免疫的功能分子，是抗原與受體及效應(yīng)分子相互作用的橋梁，其在血清中含量最高，同時半衰期最長，主要是由脾臟以及淋巴結(jié)中的漿細胞合成。與抗原分子特異性結(jié)合形成抗原-抗體復合物，改變Fc段的構(gòu)象，暴露相應(yīng)的補體結(jié)合位點，使得C1q與之結(jié)合，進而激活補體系統(tǒng)；此外，IgG可通過其Fc片段特異性識別細胞表面的Fc受體，從而產(chǎn)生多種不同的生物學效應(yīng)，主要包括：病毒中和作用、ADCC作用、胞外殺傷及免疫炎癥、吞噬調(diào)理作用

2、等。IgG-Fc段作為抗體分子與細胞及效應(yīng)分子相互作用的重要結(jié)構(gòu)域，介導細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，對抗體自身的抗原性起著決定性作用。IgG重鏈恒定區(qū)尤其是Fc段基因在不同動物間相對保守，因此分析IgG重鏈Fc基因在不同動物間的同源性，可以更加精確地反映不同動物抗體間交叉免疫原性的差異。本試驗選用貉IgG重鏈為研究對象，研究內(nèi)容主要分為三部分：
　　第一部分：貉IgG重鏈基因序列測定及分析
　　根據(jù)NCBI上已公布的犬、水貂IgG重鏈

3、基因的保守區(qū)域設(shè)計引物，從病貉的脾臟內(nèi)提取RNA。通過Race技術(shù)首次成功克隆貉IgG重鏈全基因，序列全長1474bp，編碼491個氨基酸。利用多種軟件對其IgG重鏈基因進行生物信息學分析和遺傳進化分析。核苷酸分析結(jié)果顯示貉與犬IgG間親緣關(guān)系最近，同源性為92.6％，與貓的同源性為83.0%，與水貂的同源性為82.8%，與人的同源性為75.9%，與鼠的同源性為68.2％。氨基酸序列進行比較分析發(fā)現(xiàn)，貉與犬同源性為89.6%，與水貂的同

4、源性為77.2%，與人的同源性70%左右，與鼠在60%左右。通過Swiss-model同源建模，對貉、犬IgG三維晶體結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，得出貉、犬IgG三維結(jié)構(gòu)均基于人類IgG分子建模，立體結(jié)構(gòu)的相似度保持在70%左右。關(guān)鍵氨基酸差別和三維空間結(jié)構(gòu)的不同是IgG的遺傳變異所在。
　　第二部分：不同種屬動物間IgG免疫原交叉性分析
　　不同種屬動物的IgG三維立體結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，同時其各自Fc段氨基酸殘基相對保守，預(yù)示了不同

5、動物IgG與不同動物的酶標二抗間存在交叉反應(yīng)，但其交叉反應(yīng)強度與IgG-Fc段的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。通過 dot-ELISA及Western-Blot試驗，檢測了小鼠、雞、鴨、人、貉、兔、水貂血清抗體分別與抗犬、抗兔、抗鼠和抗人四種酶標二抗間的交叉反應(yīng)性，同時分析了貉IgG-Fc融合蛋白與抗犬二抗間的免疫原交叉性。結(jié)果表明，不同動物的IgG之間，或多或少都存在一些交叉性。不同綱目之間的動物也可有一定程度的交叉免疫反應(yīng)，例如雞與犬二抗間有相對明

6、顯的交叉反應(yīng)，而與兔、鼠、人二抗間幾乎不存在免疫交叉。
　　第三部分：貉IgG-Fc多肽生物功能活性分析
　　借助文獻及在線軟件分析貉Fc區(qū)功能活性位點，人工合成貉IgG-Fc區(qū)多肽NTVSITCLVK（N10K）、PSVYVLPPSQ（P10Q）及陰性對照多肽MSTAVSKCAT（NC），F(xiàn)c多肽在不同濃度下與小鼠外周血淋巴細胞共培養(yǎng)18h檢測上清液中細胞因子含量（TNF-α,IL-1β,IL-6），發(fā)現(xiàn)在濃度為10μg/