核受體PPARγ結(jié)合小肽的篩選及初步功能鑒定.pdf

1、該研究進行了以下工作:1.在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達核受體PPARγ配體結(jié)合域的融合蛋白.經(jīng)終濃度為0.5mmol/L的IPTG在20℃誘導(dǎo)表達12小時,重組PPARγ-LBD融合蛋白得到高效表達.SDS-PAGE分析可見,表達蛋白的分子量約為34kD,近半數(shù)以可溶蛋白形式存在.2.利用Ni<'2+>-NTA純化系統(tǒng)對表達蛋白進行有效純化.純化蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶,凝膠成像系統(tǒng)軟件分析純化蛋白的純度大于90﹪

2、.3.以純化的重組PPARγ-LBD融合蛋白為靶,采用固體包被法對噬菌體展示隨機十二肽庫及環(huán)七肽庫進行親和篩選.ELISA法鑒定特異結(jié)合的高親和力陽性噬菌體單克隆并測序,獲得與PPARγ-LBD高親和力的噬菌體展示十二肽單克隆3個,環(huán)七肽單克隆5個,十二肽中出現(xiàn)LXXLL基序,環(huán)七肽序列中包含較為特征性的DXXRW序列.再經(jīng)ELISA法從測序后的陽性噬菌體展示肽中選擇與PPARγ-LBD親和力最高的肽段,進行多肽合成.4.利用PPARγ

3、的高親和力配體Rosiglitazone與噬菌體小肽進行競爭性結(jié)合抑制實驗,Rosiglitazone不影響噬菌體小肽與靶蛋白的結(jié)合.篩選所得小肽與Rosiglitazone類配體的結(jié)合位點不同.該實驗在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達,并利用Ni<'2+>-NTA系統(tǒng)分離純化,得到了純度較高的重組人PPARγ-LBD融合蛋白.利用噬菌體肽庫篩選技術(shù)從噬菌體展示十二肽及環(huán)七肽庫中獲得了具有PPARγ結(jié)合活性的十二肽及環(huán)七肽序列,它們