內(nèi)毒素休克小鼠肝臟血管特異性結(jié)合肽的體內(nèi)篩選及鑒定.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是由各種致病微生物或其毒素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是嚴(yán)重感染、重度創(chuàng)傷和燒傷、大手術(shù)和休克等臨床危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克(septic shock)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)和多器官功能障礙綜合征(multiple

2、organ dysfunction syndrome，MODS)等。
　　 膿毒癥及其并發(fā)癥是危重病醫(yī)學(xué)面臨的棘手問(wèn)題，一直是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)患者高發(fā)病率和高死亡率的主要原因，其中SIRS死亡率接近26％，膿毒癥休克的死亡率更可高達(dá)82％。當(dāng)前，膿毒癥存在著患病率高、病死率高、治療費(fèi)用高的三高現(xiàn)象，已經(jīng)構(gòu)成對(duì)人類健康的嚴(yán)重威脅和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的巨大負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，膿毒癥的患病率約為總?cè)丝?/p>

3、的0.3％，我國(guó)每年發(fā)生的總病例數(shù)超過(guò)400萬(wàn)例，并以每年約1.5％的比例增長(zhǎng)，病死率平均為40％；美國(guó)每年約有75萬(wàn)人發(fā)生膿毒癥休克，病死率可達(dá)50％以上。
　　 近年來(lái)，膿毒癥及發(fā)病機(jī)制的研究已成為十分活躍的前沿領(lǐng)域之一，日益受到國(guó)內(nèi)、外廣大臨床醫(yī)生和科研人員的高度關(guān)注。目前，在膿毒癥發(fā)病機(jī)制與臨床意義的研究上都取得了一定進(jìn)展，但膿毒癥、MODS治療的Ⅲ期臨床試驗(yàn)并未能取得預(yù)期的效果。盡管付出了巨大的努力，但由于膿毒癥發(fā)病機(jī)

4、制復(fù)雜，臨床治療困難，近40年來(lái)，其臨床療效和預(yù)后一直沒(méi)有得到實(shí)質(zhì)性地改善，已經(jīng)構(gòu)成對(duì)人類健康的嚴(yán)重威脅和經(jīng)濟(jì)社會(huì)的巨大負(fù)擔(dān)。在生命科學(xué)得到巨大發(fā)展的今天，膿毒癥仍然如此猖獗，無(wú)疑引起我們的高度重視。這些事實(shí)表明膿毒癥的根本發(fā)病環(huán)節(jié)及作用機(jī)制尚有待深入研究，新的干預(yù)途徑更值得探索。
　　 流行病學(xué)分析顯示，在細(xì)菌感染所致的膿毒癥中，有45～60％為革蘭陰性菌感染。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的結(jié)構(gòu)成分之一，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(l

5、ipopolysaccharide，LPS)，是引起膿毒癥的主要因素。LPS進(jìn)入血液循環(huán)后，可刺激單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等主要的炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，并導(dǎo)致相應(yīng)的合成和分泌功能發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞表面一些與炎癥相關(guān)的分子表達(dá)增高或暴露其相應(yīng)的活性結(jié)構(gòu)部位。與正常的細(xì)胞相比，受刺激的細(xì)胞表面存在著數(shù)量和/或結(jié)構(gòu)上具有差異的分子，這些分子可能與內(nèi)毒素休克的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為內(nèi)毒素休克治療新的候選靶點(diǎn)。這些細(xì)胞表面差異分子有

6、可能是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)時(shí)某些重要炎癥介質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，尋找其特異性結(jié)合肽，則有可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制相應(yīng)炎癥介質(zhì)與效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合，進(jìn)而中和或阻斷這些炎癥介質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)，如進(jìn)一步激活靶細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、介導(dǎo)細(xì)胞黏附等，從而達(dá)到阻斷或減輕全身性炎癥反應(yīng)發(fā)生的目的。這種對(duì)特定細(xì)胞具有靶向治療作用的生物活性肽的特點(diǎn)是更為高效和副作用小。其關(guān)鍵步驟為發(fā)現(xiàn)LPS刺激單核巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的特異性高親和力結(jié)合肽。
　　 噬菌體展示技術(shù)是20世紀(jì)90年

7、代發(fā)展起來(lái)并得到廣泛應(yīng)用的新技術(shù)，其原理是將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白將展示在噬菌體的表面，而編碼這個(gè)融合子的DNA則位于該噬菌體內(nèi)。噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)最基本的特征是將表現(xiàn)型和基因型有效聯(lián)系起來(lái)，即噬菌體表面的特定表現(xiàn)型與噬菌體顆粒中的基因型信息相對(duì)應(yīng)，如需得到某個(gè)特定的表現(xiàn)型，只需在噬菌體基因組中插入該表現(xiàn)型的相關(guān)基因即可。噬菌體展示技術(shù)使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子(抗

8、體、酶、細(xì)胞表面受體等)的多肽配體通過(guò)一種被稱為淘選(panning)的體外選擇程序得以快速鑒定。最簡(jiǎn)單的淘選程序，是將噬菌體展示肽庫(kù)與包被有靶分子的平板(或磁珠)共溫育，先洗去未結(jié)合的噬菌體，然后洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。將被洗脫的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，然后再進(jìn)行下一輪的結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán)，以富集那些可結(jié)合序列。經(jīng)3～4輪淘選后，通過(guò)DNA測(cè)序?qū)γ總€(gè)可結(jié)合克隆進(jìn)行定性。展示在噬菌體表面的隨機(jī)肽庫(kù)可應(yīng)用于許多方面的研究，包括繪制抗原表位圖譜、研究蛋

9、白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和鑒定非肽配體的肽模擬物等。
　　 Ph.D.-C7C噬菌體展示肽庫(kù)是將隨機(jī)七肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pⅢ)上而構(gòu)建成的一個(gè)組合文庫(kù)。所展示的隨機(jī)多肽兩側(cè)各有一個(gè)半胱氨酸(Cys)。在非還原條件下，這兩個(gè)半胱氨酸自發(fā)地形成一個(gè)二硫鍵，使展示的多肽環(huán)化。受限于二硫鍵環(huán)內(nèi)的7肽庫(kù)已被證實(shí)能識(shí)別抗原表位結(jié)構(gòu)、D-氨基酸靶分子的鏡像配基及開(kāi)發(fā)以多肽為基礎(chǔ)的治療藥物等。
　　 近年發(fā)展起來(lái)的體內(nèi)噬菌體

10、展示技術(shù)，是尋找組織、器官特異性結(jié)合多肽的有效手段。此方法可在受體分子尚不清楚的情況下，以受體天然存在的環(huán)境--組織器官為配基，利用噬菌體短肽的抗原特異性，尋找未知的靶分子，確定其結(jié)構(gòu)域。本研究采用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)，對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了篩選，尋找其表面分子的特異性結(jié)合肽，以期為內(nèi)毒素休克的治療及其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供新的思路與線索。
　　 我們選取4只BALB/c小鼠，雄性，8周齡，以35 mg/kg的劑量

11、腹腔注射LPS，頸動(dòng)脈插管后，監(jiān)測(cè)小鼠動(dòng)脈血壓，復(fù)制內(nèi)毒素休克模型。我們對(duì)內(nèi)毒素休克狀態(tài)下小鼠的肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了四輪篩選，然后又用正常小鼠做了一次差減篩選，即得到了與休克小鼠肝臟血管特異性結(jié)合，而與正常小鼠肝血管不結(jié)合的噬菌體文庫(kù)。我們對(duì)所篩得的噬菌體克隆進(jìn)行了一個(gè)初步的體內(nèi)回輸實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其在內(nèi)毒素休克小鼠體內(nèi)的靶向情況，一共驗(yàn)證了20個(gè)噬菌體克隆，發(fā)現(xiàn)有15個(gè)克隆為陽(yáng)性克隆(單位重量肝臟中回輸?shù)降氖删w是對(duì)照器官的三倍以上)。隨

12、機(jī)挑取噬菌體克隆，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增出其目的片段以后，進(jìn)行DNA測(cè)序，并根據(jù)插入序列推導(dǎo)出外源七肽的氨基酸序列，一共得到正確的有插入片段的序列1，063條。
　　 這些七肽序列中包含大量的三肽殘基，其中一些三肽基序作為生化識(shí)別單元(biochemical recognition units)中的配基，往往是某些功能蛋白的模擬表位(mimotooe)，因此尋找這些模擬表位及其對(duì)應(yīng)的功能蛋白具有重大意義。我們采用完全重排七肽的方法，應(yīng)用

13、混排(洗牌)算法(shuffling algorithm)，統(tǒng)計(jì)大量噬菌體展示七肽中某特定三肽出現(xiàn)的次數(shù)(豐度)及其顯著性，結(jié)果顯示，1，063個(gè)陽(yáng)性噬菌體展示七肽中包括有3，390個(gè)不同的三肽殘基，其中豐度具有顯著性意義的三肽有200個(gè)。然后，利用Clustal W軟件對(duì)包含豐度具有顯著性或豐度較高的三肽基序的七肽進(jìn)行多序列比對(duì)(multiple sequence alignment)分析，并結(jié)合氨基酸的性質(zhì)，在這些七肽中尋找特征性短

14、肽基序(模擬表位)，共得到62個(gè)特征性短肽基序；通過(guò)在線BLAST服務(wù)，將這些短肽基序同鼠蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(SWISS-PROT)進(jìn)行相似性比對(duì)分析，獲得所有已知的包含這些特征性短肽的鼠類蛋白；進(jìn)一步應(yīng)用SignalP和TMHMM預(yù)測(cè)軟件篩選其中的分泌蛋白和跨膜蛋白，從中獲得目的功能蛋白。
　　 我們對(duì)出現(xiàn)次數(shù)最多的噬菌體展示七肽(LTTWAPA)進(jìn)行了體內(nèi)導(dǎo)向效果鑒定和免疫組化染色分析。體內(nèi)導(dǎo)向效果鑒定實(shí)驗(yàn)顯示，呈現(xiàn)LTTWA

15、PA的噬菌體在休克小鼠單位重量肝臟中的回收量是8.0×108/g，分別是腎臟的40倍(2.0×107/g)，腦組織的80倍(1.0×107/g)。而在正常小鼠的驗(yàn)證中，目標(biāo)噬菌體在單位重量肝臟中的回收量與腦組織和腎臟沒(méi)有明顯差異，均遠(yuǎn)低于在休克小鼠肝臟中的回收量。對(duì)照組的空噬菌體在休克小鼠各臟器的的回收量是基本保持一致的。初步認(rèn)為，我們篩選到的該噬菌體克隆在內(nèi)毒素休克小鼠肝臟有很好的導(dǎo)向效果。
　　 免疫組化染色顯示，表達(dá)LTT

16、WAPA序列的噬菌體定位于內(nèi)毒素休克小鼠肝臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，而在休克小鼠的腦組織和腎臟以及正常小鼠的肝、腎、腦均未見(jiàn)明顯染色。同時(shí)，我們?cè)O(shè)立了同等量的空噬菌體作為對(duì)照，對(duì)照組的空噬菌體在休克小鼠和正常小鼠的肝臟均未見(jiàn)染色。說(shuō)明我們篩選到的該噬菌體能夠有效地靶向于內(nèi)毒素休克小鼠的肝臟血管，而不結(jié)合于休克小鼠的其它臟器，也不結(jié)合于正常小鼠的各臟器。
　　 總之，本研究在靶分子未知的情況下，采用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)，對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠肝臟

17、血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行4輪篩選，并與正常小鼠做了一次差減篩選，獲得與內(nèi)毒素休克小鼠肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽序列，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)這些短肽序列進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，并進(jìn)一步鑒定預(yù)測(cè)得到的功能蛋白和表位模擬肽的生物學(xué)活性。通過(guò)以上研究，我們得出以下幾點(diǎn)結(jié)論：
　　 1.成功復(fù)制了內(nèi)毒素休克小鼠模型；
　　 2.運(yùn)用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)，篩選到了內(nèi)毒素休克小鼠肝臟血管特異性結(jié)合肽庫(kù)。并且經(jīng)過(guò)四輪篩選，噬菌體文庫(kù)在內(nèi)毒素休克小鼠肝

18、臟得到了有效富集；
　　 3.隨機(jī)挑取20個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行了體內(nèi)回輸實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，有15個(gè)克隆為陽(yáng)性噬菌體克??；
　　 4.通過(guò)挑斑和PCR擴(kuò)增，得到了1，063條七肽序列，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)1，063條展示七肽中共包括有3，390個(gè)不同的三肽殘基，其中具有顯著性意義的三肽有200個(gè)；
　　 5.應(yīng)用Clustal W軟件并結(jié)合氨基酸性質(zhì)，分別對(duì)包含具有顯著性意義三肽基序的所有七肽進(jìn)行多序列比對(duì)分析，獲得了62

19、個(gè)具有表位模擬肽性質(zhì)和功能的特征性短肽；
　　 6.應(yīng)用BLASTP程序與鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析得到包含以上特征性短肽基序的蛋白2，922個(gè)，進(jìn)一步利用SignalP和TMHMM預(yù)測(cè)軟件獲得分泌蛋白和跨膜蛋白，其中分泌蛋白98條，跨膜蛋白226條，既為分泌蛋白又為跨膜蛋白的序列20條；
　　 7.對(duì)出現(xiàn)次數(shù)最多的噬菌體克隆(LTTWAPA)進(jìn)行了體內(nèi)回輸實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，體內(nèi)回輸實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)該噬菌體克隆能有效靶向于內(nèi)毒