內(nèi)毒素休克小鼠IP-10啟動子結(jié)合蛋白的鑒定及其功能研究.pdf

1、干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferoninducibleprotein10,IP-10),是新近發(fā)現(xiàn)的CXC類重要的趨化因子家族成員。IP-10通過與其特異性受體CXCR3結(jié)合,在機體發(fā)揮重要的生物學(xué)功能,殺滅微生物、抗病毒、抗腫瘤、介導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)等。在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的內(nèi)毒素休克中,LPS激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放各種細(xì)胞因子和黏附分子,其中IP-10作為一種重要的細(xì)胞因子其

2、表達(dá)量異常的升高,且在內(nèi)毒素休克小鼠的肝臟、肺臟、腎臟中IP-10的表達(dá)量均顯著升高。IP-10通過趨化炎性細(xì)胞到達(dá)炎癥組織,在一定程度上發(fā)揮殺滅病原體的作用,但過強的免疫反應(yīng)又會對機體造成損害,引起全身炎癥反應(yīng)綜合征,嚴(yán)重者導(dǎo)致機體發(fā)生多器官功能不全綜合征。
　　 IP-10在機體多種組織和細(xì)胞中都有表達(dá),包括單核巨噬細(xì)胞、活化的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、各種淋巴細(xì)胞等三十多種細(xì)胞,且多種刺激均能上調(diào)或下調(diào)IP-10基因的表達(dá),如

3、干擾素γ、干擾素α、腫瘤壞死因子-α、白介素4(interleukin,IL-4)、白介素12、血管內(nèi)皮生長因子等。不同刺激在不同細(xì)胞、不同種系可能通過不同的信號通路誘導(dǎo)IP-10基因的表達(dá),相關(guān)的調(diào)控機制也不盡相同。目前對鼠源性IP-10同源物細(xì)胞因子反應(yīng)性基因(cytokineresponsivegene-2,crg-2)的信號通路已有一些研究,但對IP-10相關(guān)的調(diào)控機制及其在內(nèi)毒素休克模型中的表達(dá)機制則知之甚少。
　　

4、基因表達(dá)的調(diào)控是細(xì)胞對外部或內(nèi)部的刺激發(fā)生應(yīng)答的方式,這是一個高度復(fù)雜,精確調(diào)控的過程,基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控可以在復(fù)制、擴增、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后多等級水平上進(jìn)行,但mRNA轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的基本控制點,即在一定時間、空間特異性的基礎(chǔ)上,由特異基因的啟動子與調(diào)節(jié)蛋白的相互作用來決定的。其實質(zhì)即DNA-蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用對RNA聚合酶活性的影響。另外,人們發(fā)現(xiàn),在基因調(diào)控過程中,往往不是單個因素起作用,而是多種調(diào)節(jié)

5、因素相互交織,相互影響,形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),最終使基因表達(dá)調(diào)控呈現(xiàn)出一種高度的有序性。鑒于這種廣泛的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA相互作用網(wǎng)絡(luò)參與其中,相關(guān)研究策略也層出不窮。其中,啟動子DNA結(jié)合蛋白的研究是從轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)的調(diào)節(jié),以尋找新的蛋白質(zhì)為手段,以了解其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用為目的,從而最終為闡明某些疾病的發(fā)病機制及基因治療奠定基礎(chǔ)。目前,對啟動子DNA結(jié)合蛋白的研究方法可分為兩大類:第一類是細(xì)胞內(nèi)法,以己知啟動子DNA序列篩

6、選出與其相結(jié)合的蛋白的編碼基因,通過生物信息分析來確定該蛋白質(zhì)；第二類是細(xì)胞外法,即在體外用重組的已知蛋白質(zhì)與啟動子DNA結(jié)合。二者各有其自身的優(yōu)勢,但又都有各自的缺陷。我們以細(xì)胞外法為基礎(chǔ),將以上二者結(jié)合應(yīng)用,以期達(dá)到既能找到未知調(diào)控蛋白,又能夠找到該蛋白質(zhì)的精確的結(jié)合位點并證實二者結(jié)合特異性的目的。
　　 由此,我們從“組學(xué)”的角度和活體組織水平,根據(jù)DNA-蛋白質(zhì)相互作用的原理,基于生物素.鏈親和素系統(tǒng)、磁珠分離技術(shù),結(jié)合

7、生物質(zhì)譜技術(shù)篩選了內(nèi)毒素休克小鼠的肝臟組織中與IP-10啟動子發(fā)生相互作用的結(jié)合蛋白,并對鑒定出的重要調(diào)控元件高遷移率族蛋白1(highmobilitygroupbox1,HMGB1)進(jìn)行了進(jìn)一步的體外結(jié)合驗證及對IP-10基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用等方面的深入研究。
　　 利用末端生物素(biotin)標(biāo)記的IP-10啟動子區(qū)引物,PCR擴增制備IP-10啟動子區(qū)探針(IP-10p-biotin)。制備內(nèi)毒素休克動物模型(BALB/c

8、小鼠),提取肝臟組織胞核蛋白,與擴增的IP-10p-biotin探針行結(jié)合反應(yīng),再以標(biāo)記有鏈親和素(streptavidin)的磁珠分離IP-10p-biotin-蛋白反應(yīng)復(fù)合物,不同鹽濃度緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白,使用聚丙稀酰胺凝膠電泳分離洗脫的樣品蛋白,并對凝膠行銀染顯色,比較內(nèi)毒素休克組與正常對照組的差異條帶(DNA.pull-downassay)。結(jié)果表明,在肝臟組織胞核中,共有17個蛋白可能參與了內(nèi)毒素休克小鼠肝臟中IP-10的表

9、達(dá)調(diào)控。其中14個蛋白在LPS作用后與IP-10啟動子結(jié)合增加,提示這些蛋白在LPS作用后可能參與了IP-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),而另外3個蛋白則在LPS作用后,與正常對照組相比作用減弱或消失,且多次重復(fù)均得到相同的結(jié)果。
　　 對結(jié)果中出現(xiàn)的17個差異條帶行切膠進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,根據(jù)得到的肽指紋圖譜,利用Mascot查詢軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫,綜合分析后得到五個與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的蛋白分子,分別為高遷移率蛋白家族的高遷移率族蛋白1(highm

10、obilitygroupbox1,HMGB1)和高遷移率族蛋白2(highmobilitygroupbox2,HMGB2),組蛋白3(histone3,H3),乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶(acetyl-CoenzymeAacyltransferase2,ACAA2)及甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白(thyroidhormonereceptorassociatedproteins,TRAP)。其中,HMGB1、HMGB2最初發(fā)現(xiàn)其即作為核因子參與基因的

11、轉(zhuǎn)錄調(diào)控,它們主要通過修飾,彎曲或改變?nèi)旧|(zhì)/DNA的結(jié)構(gòu),促進(jìn)各種蛋白因子形成大分子復(fù)合物來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄；組蛋白H3作為染色體結(jié)構(gòu)中高度保守的一類核心組蛋白(corehistone),主要通過其乙?；降恼{(diào)節(jié)控制基因轉(zhuǎn)錄的“開”和“關(guān)”；乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶則通過對組蛋白、HMGB1、HMGB2的乙?；瘏⑴c基因調(diào)控；甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白是新進(jìn)研究的轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)因子的一類中介因子,它主要通過與轉(zhuǎn)錄激活因子、RNA聚合酶Ⅱ及基本轉(zhuǎn)錄因子(

12、generaltranscriptionfactors,GTFs)相互接觸從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的裝配。質(zhì)譜鑒定得到的這些結(jié)果充分說明內(nèi)毒素休克小鼠中IP-10基因的表達(dá)調(diào)控可能受到了多種因素的影響,這些因素相互協(xié)調(diào),共同作用從而影響IP-10基因的表達(dá)調(diào)控。
　　 鑒于HMGB1在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要作用,我們將其作為IP-10基因調(diào)控中的重要因子對其進(jìn)行了多方面的驗證,主要包括體外結(jié)合實驗,細(xì)胞免疫熒光和Westernblott

13、ing分析體外IP-10與HMGB1的結(jié)合活性、內(nèi)源性的HMGB1的定位及其表達(dá)情況。首先,表達(dá)純化出帶組氨酸(His)標(biāo)簽的HMGB1融合蛋白,將其包被至耦合有鎳離子的熒光微球上,將其與末端帶biotin標(biāo)記的IP-10啟動子全長以不同的摩爾比行體外結(jié)合反應(yīng),加入耦聯(lián)有鏈霉親和素的熒光發(fā)光劑PE后,利用液相芯片系統(tǒng)(LiquiChipworkstation)檢測各組DNA-蛋白的結(jié)合強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1同IP-10啟動子在體外有高

14、親合力,且當(dāng):DNA:protein投入的摩爾比為2:1時,二者的結(jié)合趨于平臺期。這個結(jié)果同已知的HMGB1蛋白上存在兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HMGbox結(jié)構(gòu)域)相一致。
　　 同時,我們用Westernblot檢測內(nèi)毒素休克小鼠肝臟組織中HMGB1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示在LPS刺激后胞核蛋白中HMGB1的表達(dá)量0.5h開始增多,隨后恢復(fù)至正常,至3h又有所增高,之后開始逐漸下降,同時總蛋白也有類似的變化趨勢。此外,在我們用培養(yǎng)

15、的人肝癌細(xì)胞株SMMC7721細(xì)胞,檢測內(nèi)源性的HMGB1的定位試驗中觀察到LPS刺激后早期,HMGB1特異的定位于細(xì)胞核內(nèi),這樣的結(jié)果提示我們HMGB1作為核因子主要在基因表達(dá)的早期參與調(diào)控,而且我室早期的研究工作即表明,在LPS刺激的內(nèi)毒素休克小鼠肝臟組織中1h即檢測到IP-10的升高,且在3h達(dá)到高峰,由此可以初步推斷HMGB1在IP-10基因表達(dá)調(diào)控過程中,主要應(yīng)該發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平的改變,即早期使HMGB1的表達(dá)增加,從而參與調(diào)控

16、早期IP-10基因的上調(diào)。
　　 通過以上研究,我們得出以下結(jié)論:一:利用生物素-鏈親和素、磁珠分離技術(shù)成功篩選到參與IP-10基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子,在胞核蛋白中至少有17個蛋白可能參與了這一過程,并利用生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定相關(guān)蛋白為HMG家族的HMGB1與HMGB2,組蛋白H3,乙?；D(zhuǎn)移酶,甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白；二:在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)純化出帶His標(biāo)記的HMGB1蛋白,并與末端帶biotin標(biāo)記的IP-10啟動子全長以不同的摩爾比

17、體外結(jié)合,利用Lquichip液相芯片分析系統(tǒng)在體外驗證了二者的相互作用,在DNA:protein為2:1時,二者的結(jié)合趨于平臺。三:細(xì)胞免疫熒光、Westernblot結(jié)果表明,在LPS刺激的小鼠肝臟組織胞核蛋白中,早期HMGB1的表達(dá)即明顯升高,且細(xì)胞定位實驗也在核內(nèi)檢測到HMGB1的表達(dá),提示HMGB1對IP-10的表達(dá)調(diào)控作用主要發(fā)生在內(nèi)毒素休克的早期,從而發(fā)揮IP-10在內(nèi)毒素休克早期對機體的保護(hù)作用。
　　 本研究利