環(huán)加氧酶-2啟動(dòng)子區(qū)抑制性結(jié)合蛋白的鑒定和功能分析.pdf

1、環(huán)加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是體內(nèi)催化花生四烯酸合成前列腺素類(lèi)物質(zhì)的關(guān)鍵酶，在炎癥、腫瘤和糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。有關(guān)它的表達(dá)調(diào)控研究很多，但尚有一些機(jī)制未被闡明。本研究旨在定位小鼠COX-2啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制元件，鑒定此元件的結(jié)合蛋白并對(duì)其進(jìn)行功能分析。通過(guò)在胰島β細(xì)胞RINm5F中對(duì)COX-2啟動(dòng)子進(jìn)行的一系列缺失和突變分析，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄抑制元件位于啟動(dòng)子-655/-632之間。

2、在電泳遷移率轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)中，以此段序列為探針，與RINm5F細(xì)胞的核提取物共孵育，出現(xiàn)了三個(gè)遷移條帶，說(shuō)明核提取物中有三種蛋白(或蛋白復(fù)合體)與轉(zhuǎn)錄抑制元件相結(jié)合。根據(jù)這些蛋白與轉(zhuǎn)錄抑制元件之間的特異結(jié)合能力，將它們純化出來(lái)，然后經(jīng)質(zhì)譜分析，其中一種蛋白被鑒定為不含POU結(jié)構(gòu)域的八核苷酸結(jié)合蛋白(non-POU-domain-containing，octamer binding protein，Non0)。進(jìn)一步對(duì)Nono進(jìn)行功能分析，我們

3、發(fā)現(xiàn)，它參與了電泳遷移率轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)中遷移率較慢的兩條帶的形成，以它經(jīng)典的結(jié)合序列一八核苷酸基序(octamer)作為冷探針，可以完全抑制遷移率較慢的兩條帶的形成，而對(duì)遷移率最快的一條帶沒(méi)有作用。研究結(jié)果還顯示， Nono的過(guò)量表達(dá)能顯著抑制COX-2啟動(dòng)子的活性；而將轉(zhuǎn)錄抑制元件所在的位點(diǎn)突變后，Nono的過(guò)表達(dá)對(duì)啟動(dòng)子活性的抑制作用消失。這說(shuō)明Nono確實(shí)是通過(guò)結(jié)合到這個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制元件發(fā)揮下調(diào)COX-2啟動(dòng)子活性的作用。本文的研究結(jié)果首次