鈍頂螺旋藻耐鹽相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)構(gòu)與功能分析.pdf

1、目的：
　　螺旋藻(Spirulina)是一類進(jìn)化歷史悠久、含葉綠素a（但不形成葉綠體）、能進(jìn)行產(chǎn)氧性光合作用的大型原核生物。其抗逆性強(qiáng)，在熱泉、鹽水湖及其他惡劣環(huán)境中，是唯一或主要的光養(yǎng)生物;螺旋藻已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，如光合作用、細(xì)胞分化與氮的固定、碳源與氮源的利用、抗環(huán)境脅迫以及分子進(jìn)化等領(lǐng)域。本課題通過(guò)研究螺旋藻耐鹽堿基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及與調(diào)控基因功能的關(guān)系，揭示螺旋藻耐鹽堿的分子機(jī)理。鑒定螺旋藻抗逆相關(guān)基因，可為植物基因

2、工程育種提供新的功能基因，也為培育抗逆性增強(qiáng)的螺旋藻新品種、挖掘其他藻類抗逆功能相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)，具有重要的科學(xué)意義，將產(chǎn)生一定的社會(huì)效益。
　　方法：
　　1設(shè)計(jì)引物，提取螺旋藻總DNA，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增鈍頂螺旋藻RuBisCO基因5'端上游啟動(dòng)子區(qū)域199bp的片段(pro);設(shè)計(jì)擴(kuò)增綠色熒光蛋白(GFP)基因引物，以攜帶GFP基因的質(zhì)粒為模1板擴(kuò)增GFP基因;以RuBisCO基因啟動(dòng)子區(qū)域片段和綠色熒光蛋白基因（gf

3、p）片段為模板，通過(guò)重組PCR技術(shù)，得到含啟動(dòng)子區(qū)域和GFP基因的DNA片段。
　　2重組PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體相連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌JM109。限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定重組克隆片段，最后測(cè)序驗(yàn)證目的基因。
　　3檢測(cè)不同鹽濃度下pMD18-pro∷g/E.coli JM109轉(zhuǎn)化子的熒光強(qiáng)度。
　　4利用生物信息學(xué)方法對(duì)這一啟動(dòng)子區(qū)域中可能存在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用步移缺失設(shè)計(jì)引物以獲得1

4、0段長(zhǎng)度不等的pro-gfp片段，再克隆入pMD18-T載體并導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109。
　　5培養(yǎng)并觀察各突變個(gè)體中的綠色熒光蛋白表達(dá)情況。
　　6定點(diǎn)突變分析-35區(qū)六核苷酸(TTGACT)的精確位置。
　　結(jié)果：
　　1螺旋藻耐鹽相關(guān)基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物的片段大小為199bp，GFP基因PCR產(chǎn)物的片段大小為717bp，重組PCR的片段大小為916bp，與預(yù)期的結(jié)果吻合。
　　2重組PCR產(chǎn)物和p

5、MD-18T載體成功連接，并成功轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌JM109，經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定，序列正確無(wú)誤。
　　3實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LB液體培養(yǎng)基含0.2M、0.4M、0.6M和0.8M NaCl條件下，pMD18-pro∷gfp/E.coli JM109轉(zhuǎn)化子GFP的熒光水平均高于正常培養(yǎng)條件對(duì)照組(0.02M NaCl)，表明該啟動(dòng)子可以被高濃度的鹽所誘導(dǎo)。
　　4 PCR擴(kuò)增得到了上述重組產(chǎn)物的10條步移缺失片段，成功構(gòu)建10個(gè)

6、缺失突變表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌JM109。
　　5突變體1-9均能發(fā)出綠色熒光，而突變體10不能發(fā)光。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)出鈍頂螺旋藻耐鹽相關(guān)基因RuBisCO基因的核心啟動(dòng)子區(qū)為第二種預(yù)測(cè)結(jié)果，即位于-94～-54bp之間，同時(shí)該區(qū)域內(nèi)的TTGACT與TATTTT序列分別相當(dāng)于原核生物核心啟動(dòng)子區(qū)的-35區(qū)與-10區(qū)。
　　6定點(diǎn)突變分析表明，當(dāng)-35區(qū)TTGACT第六個(gè)核苷酸(T)改為A，啟動(dòng)子的活性保持不變。

7、然而，當(dāng)?shù)谝籘或第二T被突變后，啟動(dòng)子的活性急劇下降;當(dāng)-35區(qū)TTGACT與-10區(qū)TATTTT被插入或者刪除四個(gè)堿基，啟動(dòng)子的活性急劇下降。
　　結(jié)論：
　　鈍頂螺旋藻耐鹽相關(guān)基因RuBisCO基因的核心啟動(dòng)子區(qū)位于-94～-54bp之間，同時(shí)該區(qū)域內(nèi)的TTGACT與TATTTT序列分別相當(dāng)于原核生物核心啟動(dòng)子區(qū)的-35區(qū)與-10區(qū)，且這兩個(gè)區(qū)之間、以及TATTTT與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間相隔的位置均為最佳距離。當(dāng)-35區(qū)TT