豆野螟性信息素結(jié)合蛋白MvitPBPs基因的鑒定及功能分析.pdf

1、昆蟲在競爭激烈的自然環(huán)境中不斷繁衍生存，主要受益于其敏銳的嗅覺系統(tǒng)。昆蟲通過發(fā)達(dá)的嗅覺系統(tǒng)感知同類或天敵發(fā)出的性信息素或預(yù)警信息素，不僅能尋找配偶進(jìn)行交配和躲避天敵，還能通過感知寄主植物發(fā)出的揮發(fā)性信息素進(jìn)行寄主識別和產(chǎn)卵定位等。昆蟲嗅覺系統(tǒng)中OBPs起著重要的作用，鱗翅目昆蟲根據(jù)OBPs的特點將其分為兩類:GOBPs和PBPs，PBPs在昆蟲兩性交流中扮演著重要的角色。
　　豆野螟是廣泛危害豆類作物的世界性農(nóng)業(yè)害蟲，主要分布于熱

2、帶及亞熱帶地區(qū)。以幼蟲的鉆蛀行為而聞名，主要危害豆科植物幼嫩的花、豆莢等。課題組前期進(jìn)行了豆野螟觸角轉(zhuǎn)錄組測序，本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)方法分析利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)擴增得到3個PBPs基因，qRT-PCR分析檢測PBPs基因在不同組織和全身的表達(dá)譜，之后體外原核表達(dá)純化目的蛋白并利用熒光競爭結(jié)合實驗初探其生理功能，結(jié)果如下:
　　1、豆野螟MvitPBPs的克隆、序列和進(jìn)化分析
　　基因克隆得到三令PBPs，并將其命名

3、為MvitPBP1、MvitPBP2、MvitPBP3，分析得出MvitPBPs ORF分別為495，501，519bp。多重序列比對顯示:MvitPBP1與BmorPBP1的序列一致性為47.27％，MvitPBP2與AtraPBP2的序列一致性為48.82％，MvitPBP3與ApolPBP3的序列一致性為43.03％。系統(tǒng)進(jìn)化分析得出:MvitPBP1與二化螟CsupPBP1聚為一支，MvitPBP2與亞洲玉米螟OnubPBP4聚

4、為一支，MvitPBP3與稻縱卷葉螟CmedPBP2聚為一支。
　　2、熒光定量表達(dá)譜分析
　　利用qRT-PCR檢測MvitPBPs在不同組織以及全身的表達(dá)水平，結(jié)果表明:三個基因主要在嗅覺感器集中分布的觸角中表達(dá)，并相對其他組織具有明顯的差異性;其表達(dá)水平同時具有性別差異性，MvitPBP1偏雄性表達(dá)，MvitPBP2和MvitPBP3偏雌性表達(dá)，推測此類基因在豆野螟行為反應(yīng)中發(fā)揮著不同的功能。
　　3、MvitP

5、BPs原核表達(dá)及純化
　　為初步探究MvitPBPs的功能采用原核表達(dá)技術(shù)體外表達(dá)目的蛋白。首先構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a(+)-PBPs，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)至上清，之后Ni柱親和層析純化目的蛋白，最后腸激酶切除His標(biāo)簽。SDS-PAGE表明三個蛋白大小都幾乎接近27 kDa，并在圖上呈現(xiàn)出較粗的條帶。
　　4、熒光競爭結(jié)合實驗
　　首先測定MvitPBPs與豆野螟4種性信息素

6、的結(jié)合特性，結(jié)果表明MvitPBPs與4種性信息素都能發(fā)生結(jié)合。MvitPBP1與MvitPBP3對E10E12-16: Ald的結(jié)合力最強，而MvitPBP2偏好E10-16: Ald，說明這兩種成分可能是豆野螟性信息素的主要組分，MvitPBPs對烯醛類化合物有較高的偏好性。
　　其次檢測MvitPBPs與19種豇豆花揮發(fā)物的結(jié)合特性，結(jié)果表明MvitPBP1和MvitPBP2能與揮發(fā)物結(jié)合，但結(jié)合能力較弱，未表現(xiàn)出明顯的差異

7、性。MvitPBP3則能顯著結(jié)合Butanoic acid octyl ester（丁酸辛酯），與本課題組前期在研究MvitGOBP2功能時得出MvitGOBP2與丁酸辛酯的結(jié)合能力最強相似。
　　綜上所述，豆野螟MvitPBPs與其他鱗翅目昆蟲PBPs表現(xiàn)出的功能類似，在兩性識別中扮演著重要的角色，其中MvitPBP1發(fā)揮的作用極其顯著。MvitPBP3還能與豇豆花揮發(fā)物Butanoic acid octyl ester發(fā)生極特