稻縱卷葉螟氣味結合蛋白的功能分析.pdf

1、昆蟲的嗅覺在其生命活動過程中起著重要作用，許多研究表明氣味結合蛋白(OBPs)參與了識別外界物質(zhì)的第一步，但對于OBPs在昆蟲中確切的生理功能并不是很清晰。稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medmalis是水稻上重要的害蟲，我們通過觸角轉錄組測序，鑒定了多個CmedOBPs基因，但對于CmedOBPs在其嗅覺感受中的功能并不是很清晰。為此，本課題擬以稻縱卷葉螟為研究對象，在克隆其CmedOBPs基因及CmedOBPs基因表達模式

2、分析的基礎上，通過體外結合實驗并結合RNAi技術，對CmedOBPs的功能進行探索，以期為明確稻縱卷葉螟寄主定位的分子機制提供依據(jù)。主要研究結果如下:
　　1.稻縱卷葉螟翅和足的掃描電鏡觀察
　　掃描電鏡的結果顯示，稻縱卷葉螟雌雄成蟲翅上主要有非嗅覺感器鱗形和刺形兩種感器。稻縱卷葉螟的足上除了嗅覺感器錐形和毛形感器外還有鱗形感器、刺形感器和B(o)hm鬃毛3種非嗅覺感器，數(shù)量統(tǒng)計顯示前足感器多于后足，后足多于中足。雌雄翅及足

3、上的感器無性二型現(xiàn)象。
　　2.稻縱卷葉螟CmedOBPs基因克隆及序列分析
　　本實驗成功克隆出CmedOBP5、CmedOBP8、CmedOBP10、CmedOBP13、CmedOBP14、CmedOBP20共6個基因。序列分析發(fā)現(xiàn)CmedOBP5、CmedOBP8和CmedOBP14都有6個保守的半胱氨酸Cys，符合Classic OBPs的特征;而CmedOBP13有7個Cys，CmedOBP10有15個保守的Cys

4、，屬于Plus-C OBPs;CmedOBP20有5個Cys，屬于Minus-C OBPs。信號肽預測結果表明，CmedOBP5、CmedOBP8、CmedOBP10、CmedOBP13、CmedOBP14、CmedOBP20分別含有18、17、20、22、25和16個信號肽。
　　3.稻縱卷葉螟CmedOBPs基因的時空表達
　　對上述6個基因在雌雄蟲羽化后，交配未交配、各日齡段、各組織部位的表達量用熒光定量的方法進行分析

5、。結果顯示CmedOBP13、CmedOBP14、CmedOBP20主要在3日齡成蟲觸角(At)高表達，雌雄間有差異，可能主要行使化學感受的作用;其它3個基因在主要組織部位的表達量因成蟲齡期、性別和交配狀態(tài)的不同而有一定差異，CmedOBP5主要在1日齡雌雄成蟲翅中(W)高表達;CmedOBP8主要高表達于雌雄成蟲脂肪體(Fa);CmedOBP10主要在未交配的5日齡雌雄蟲頭部(H)高表達，可能行使其它生理功能。
　　4.Cmed

6、OBP5和CmedOBP14的表達、純化及結合特性分析
　　以實驗室已有載體構建了重組質(zhì)粒pET-22b(+)-CmedOBP14、pET-22b(+)-CmedOBP5、pET-30a(+)-CmedOBP16、pET-30a(+)-CmedOBP20、pET-28a(+)-CmedOBP10和pET-28a(+)-CmedOBP13。使其在表達菌株表達后，獲得了純蛋白CmedOBP5和CmedOB P14。熒光競爭結合實驗結果

7、顯示，CmedOBP14與37種水稻揮發(fā)物的結合力除烷烴類和己醛外在中性條件下比在酸性條件下要強一些。除反-2-己醛，(-)-檸檬烯、3-蒈烯、橙花叔醇外，CmedOBP5在pH=7.4條件下與揮發(fā)物的結合力高于pH5.0。這可能與pH的不同引起OBPs不同的構象變化有關。
　　選取與CmedOBP5結合能力較強的5種物質(zhì)（側柏烯、柏木腦、十六烷、順-3-己烯醇、石竹烯）在16℃和27℃下進行熒光猝滅實驗。結果顯示柏木腦和順-3-

8、己烯醇與CmedOBP5呈穩(wěn)定靜態(tài)結合，計算其結合常數(shù)和結合位點，得出其作用力均為疏水作用力。
　　5.行為活性物質(zhì)的篩選
　　查找文獻發(fā)現(xiàn)在熒光競爭實驗中與CmedOBP14結合能力較強的揮發(fā)物中有13種揮發(fā)物能導致稻縱卷葉螟產(chǎn)生強烈的電生理信號。為進一步了解CmedOBP14在稻縱卷葉螟嗅覺感受中的功能，利用觸角電位(EAG)技術測定了注射dsCmedOBP14后，稻縱卷葉螟對揮發(fā)物的EAG反應。結果表明，注射dsRNA

9、后稻縱卷葉螟成蟲對橙花叔醇(Nerolidol)、檸檬烯((-)-Limonene）、β-紫羅蘭酮(β-ionone)、十六烷(Hexadecane)、二十一烷(Henicosane)的EAG反應顯著降低。
　　利用H-型嗅覺儀，測定了稻縱卷葉螟對上述5種揮發(fā)物行為反應。結果表明，橙花叔醇、檸檬烯、十六烷和二十一烷等幾種物質(zhì)對稻縱卷葉螟具有顯著的引誘作用，β-紫羅蘭酮則具有趨避作用。注射dsCmedOBP14后，稻縱卷葉螟對橙花叔