稻縱卷葉螟寄主定位及其氣味結(jié)合蛋白功能的研究.pdf

1、昆蟲的嗅覺在昆蟲取食、交配及產(chǎn)卵等方面發(fā)揮重要作用，而氣味結(jié)合蛋白(OBPs)在其嗅覺感受過程中起著重要的功能。如果能夠明確昆蟲寄主定位的分子機制，則可為研制昆蟲行為調(diào)節(jié)劑提供重要的理論依據(jù)和技術支持。稻縱卷葉螟Cnqphalocrocis medinalis(Guenée)是水稻上重要的害蟲，基于行為調(diào)控的防治，成為防治稻縱卷葉螟的重要手段。為此，本文以稻縱卷葉螟為研究對象，在通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對水稻揮發(fā)物分離鑒定

2、的基礎上，利用觸角電位儀(EAG)對稻縱卷葉螟具有電生理活性的物質(zhì)進行了篩選;在分析OBPs基因表達與其行為相關性的基礎上，通過熒光競爭結(jié)合、分子對接及RNA干擾等對OBPs的功能進行探索，以期為明確稻縱卷葉螟嗅覺感受的分子機制及研發(fā)其行為調(diào)節(jié)劑提供理論和技術支持。主要研究結(jié)果如下:
　　1.稻縱卷葉螟對寄主揮發(fā)物的觸角電位反應
　　利用EAG篩選出了對不同生理時期稻縱卷葉螟具有電生理活性的揮發(fā)物。結(jié)果表明，十九烷、(Z)-

3、3-己烯醇、(E)-2-己烯醇、(Z)-2-己烯醇、庚醇、環(huán)己醇、芳樟醇、己醛和水楊酸甲酯等揮發(fā)物能引起稻縱卷葉螟強烈的EAG反應。EAG梯度實驗結(jié)果表明，揮發(fā)物對成蟲的吸引作用具有其最適劑量范圍，一旦超出這個閾值則活性減弱，甚至對行為有排斥作用。揮發(fā)物的結(jié)構、濃度和稻縱卷葉螟的生理狀態(tài)（如日齡、性別及交配狀況）均能顯著性影響稻縱卷葉螟對寄主揮發(fā)物的電生理反應。
　　2.稻縱卷葉螟對非轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因水稻的產(chǎn)卵選擇
　　研究了

4、轉(zhuǎn)cry2A基因水稻品種T2A-1對稻縱卷葉螟產(chǎn)卵行為的影響。結(jié)果表明，不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻的電子鼻雷達圖譜和主成分具有很高的相似度;揮發(fā)物的種類及相對含量、水稻葉片表面的硅細胞和絨毛的數(shù)量在兩種水稻品種之間均無顯著性差異;與常規(guī)水稻相比，稻縱卷葉螟對轉(zhuǎn)基因水稻的產(chǎn)卵偏好性沒有顯著性差異。轉(zhuǎn)基因水稻不會影響靶標害蟲稻縱卷葉螟的產(chǎn)卵行為。
　　3.稻縱卷葉螟觸角感器的顯微觀察
　　通過掃描電鏡和透射電鏡觀察，在雌、

5、雄觸角上共發(fā)現(xiàn)了8種感器，分別為毛形感器、錐形感器、腔錐形感器、栓錐形感器、鱗形感器、耳形感器、B(o)hm鬃毛和壇形感器。毛形感器可能與感受寄主揮發(fā)物有關，錐形感器則可能在感受性信息素方面發(fā)揮重要作用，壇形、腔錐形感器可能與感受溫濕度和CO2有關，Bohm鬃毛可能與感受昆蟲運動的方向和速度有關。每種感器都有其特定的分布模式，并且感器在雌、雄個體觸角上的形態(tài)、分布位置及數(shù)量呈性二型。
　　4.稻縱卷葉螟氣味結(jié)合蛋白的時空表達

6、>　　構建了稻縱卷葉螟觸角的cDNA文庫，獲得2個普通氣味結(jié)合蛋白(CmedOBP2和CmedOBP3)。時空表達結(jié)果表明，CmedOBPs特異性的表達在稻縱卷葉螟的觸角中，且表達量與日齡、性別和交配狀況等密切相關:和蛹期相比，CmedOBPs在成蟲期的表達量顯著提高;CmedOBPs在雄蟲的表達量高于雌蟲，CmedOBP2在1日齡雄蟲觸角的表達量約為同日齡雌蟲的100倍;CmedOBPs在交配后的表達量比交配前有提高，但差異不顯著。C

7、medOBPs的表達與稻縱卷葉螟的行為具有相關性。
　　5.稻縱卷葉螟氣味結(jié)合蛋白的功能分析
　　熒光競爭結(jié)合結(jié)果表明，CmedOBPs與寄主揮發(fā)物的結(jié)合特性取決于配體的種類、pH環(huán)境和OBPs的協(xié)同效應。通過同源建模和分子對接表明，氨基酸Phe120、Ala121、Ile49、Tyr50、Tyr74、Thr53和Val55主要參與了CmedOBP2與氣味分子的結(jié)合，而氨基酸Tyr136、Phe137、Ser128、His1

8、09、His125、Met103和Val124在CmedOBP3與氣味分子的結(jié)合中發(fā)揮主要作用。RNA干擾結(jié)果表明，當注射dsRNA-CmedOBP2時，CmedOBP2基因的表達量下調(diào)，CmedOBP3基因的表達量會顯著上調(diào)以補償其嗅覺功能，反之亦然。注射dsRNA-CmedOBP2或CmedOBP3，稻縱卷葉螟對(Z)-3-己烯醇、2-庚酮和α-雪松烯的EAG反應顯著性降低，當注射dsRNA-CmedOBP2&3時，稻縱卷葉螟對揮發(fā)