家蠶F-box蛋白的定位分析及其功能研究.pdf

1、F-box蛋白是一類隨著研究的深入而日益擴(kuò)大的蛋白家族，它的一個(gè)共同特征是含有F-box結(jié)構(gòu)域。作為SCF復(fù)合體(Skpl-Cullinl-F-box.E3連接酶的一部分，F(xiàn)-box蛋白是泛素蛋白降解系統(tǒng)的重要組成部分，它可參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分裂與分化等多種重要的生物調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　 我們從本實(shí)驗(yàn)室家蠶蛹cDNA文庫(kù)獲得一個(gè)編碼F-bo.only蛋白的基因，該基因序列全長(zhǎng)213.bp，開(kāi)放閱讀框架(ORF)182.bp，編碼

2、606個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量70 kD，GenBank登錄號(hào)為DN237283.1，我們將其命名為BmFBX021(F-bo.onl.protei.21)。通過(guò)蛋白序列同源性比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)該蛋白與其他物種中相關(guān)蛋白具有一定同源性，但同源率不高，在20％-30％2間；通過(guò)潛在磷酸化位點(diǎn)和功能位點(diǎn)分析，我們預(yù)測(cè)該蛋白可能跟某個(gè)細(xì)胞過(guò)程的順利進(jìn)行或調(diào)控有關(guān)。為了制備抗BmFBXO21蛋白的多克隆抗體，我們將BmFBXO21基因的一部分進(jìn)行P

3、CR擴(kuò)增后克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上，成功構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-BmFBXO21。將該重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2.(DE3)，IPTG誘導(dǎo)重組菌后，裂解菌體作SDS-PAGE分析，顯示在預(yù)期位置有一條特異性蛋白條帶，且以包涵體的形式存在。用尿素溶解的方法處理包涵體后以親和層析的方法純化融合蛋白His-BmFBXO21。純化后的蛋白進(jìn)行FPLC反相柱分析，檢測(cè)到純度高達(dá)90％以上；質(zhì)譜鑒定純化的融合蛋

4、白的分子量與理論值非常接近，說(shuō)明融合蛋白表達(dá)純化成功。用純化的目的蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔，制備了該蛋白的多克隆抗體，獲得的抗體用間接ELISA法測(cè)得其效價(jià)為1:12800以上，Wester.blot檢測(cè)抗體的特異性良好，自制的抗體符合進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的要求。我們對(duì)BmFBXO21基因在mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)以及免疫組織化學(xué)定位三個(gè)不同方面進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果顯示該基因在吐絲期蠶中表達(dá)量最高，主要分布于該時(shí)期蠶的頭部、表皮、生殖腺和腸