內(nèi)毒素休克小鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是感染引起的全身炎癥反應(yīng)征候群，其嚴(yán)重并發(fā)癥--感染性休克(septic shock)是創(chuàng)傷、燒傷和手術(shù)后病人最主要的死亡原因之一。統(tǒng)計(jì)表明，臨床半數(shù)的膿毒癥是由于革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)感染引起的，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，或稱為內(nèi)毒素(endotoxin)，被認(rèn)為是革蘭氏陰性菌引起膿毒癥的主要作用分子。LPS廣泛作用于機(jī)體

2、多種組織器官，其中內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是最主要的效應(yīng)細(xì)胞。在LPS的刺激下，它們產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytokine storm)，進(jìn)而引起失控性的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙(mutiple organ dysfunction)。因此，膿毒癥或內(nèi)毒素休克(endotoxic shock)的分子機(jī)制的研究大多集中在內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上，而在其它組織和器官上的相對(duì)研究較少

3、。
　　 肝臟是人體代謝的樞紐，也是重要的免疫器官，血液中大量蛋白也是由肝臟合成分泌的。在膿毒癥的炎性應(yīng)激刺激下，肝臟可以大量合成并分泌急性期蛋白(acute phase protein，AP)，如C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、α1-蛋白酶抑制劑(α1-proteinase inhibitor)、結(jié)合珠蛋白(haptoglobin)、纖維蛋白原(fibrinogen)及補(bǔ)體(complement)

4、等，可以啟動(dòng)迅速的機(jī)體防御機(jī)制。然而肝臟對(duì)病原微生物或其毒性產(chǎn)物產(chǎn)生什么樣的反應(yīng)?膿毒癥或感染性休克發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中肝臟自身變化如何?肝臟通過什么樣的分子調(diào)控機(jī)制調(diào)控多種炎癥相關(guān)反應(yīng)蛋白的表達(dá)?對(duì)于這些問題，目前所知有限。然而，對(duì)這些問題的解答，對(duì)于了解錯(cuò)綜復(fù)雜的膿毒癥及其感染性休克的發(fā)病機(jī)制無疑是有益的。
　　 LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)是內(nèi)毒素致病過程中的重要環(huán)節(jié)，而LPS與細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合是其啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)反應(yīng)的第一步。近

5、年來對(duì)LPS受體識(shí)別機(jī)制的研究取得了重要進(jìn)展。發(fā)現(xiàn)LPS的受體并非單一受體。在LPS的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，LPS與分化抗原-14(CD-14)結(jié)合后作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層并激發(fā)多種生物活性分子，它們相互作用、聚集在一起形成LPS受體簇，共同完成LPS的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中包括Toll樣受體-4(Toll-like receptor4，TLR4)、髓樣分化蛋白-2(MD-2)、β2-整合素(CD11b/CD18)、分化抗原-55(CD55

6、)、分化抗原-81(CD81)、熱休克蛋白-70(heat shock protein70，HSP70)、熱休克蛋白-90(heat shock protein90，HSP90)、生長分化因子-5(growth-differentiationfactor5，GDF5)以及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子受體(chemokine receptor4，CXCR4)等。研究發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激前，CD14、HSP70、HSP90就存在于細(xì)胞膜脂質(zhì)層中，而TLR

7、4、CXCR4、GDF5僅在LPS刺激后才聚集在脂質(zhì)層中。在LPS識(shí)別過程中，CD14的主要功能是催化LPS從細(xì)胞外空間轉(zhuǎn)運(yùn)到膜上相關(guān)復(fù)合受體，TLR4-MD2復(fù)合物僅是LPS受體簇的一部分。并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脂質(zhì)分子層的完整性不影響受體分子在細(xì)胞膜上的表達(dá)，但破壞脂質(zhì)層的形成可以抑制LPS對(duì)細(xì)胞的活性作用，這些抑制作用可以直接歸因于脂質(zhì)層破壞劑對(duì)LPS受體簇(HSP70、HSP90、CXCR4、GDF5、CD14和TLR4)的置換作用而非其它

8、的非特異性效應(yīng)。另外，某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子如髓樣細(xì)胞分化因子等在LPS刺激后也募集到脂質(zhì)雙分子層。由此可見細(xì)胞膜脂質(zhì)層是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)集中的區(qū)域。越來越多的研究資料表明，在LPS的識(shí)別及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中用單一受體模式來解釋太過簡單，在此過程中包含著多個(gè)受體在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)區(qū)域的協(xié)同作用。同一類型細(xì)胞亦可存在多個(gè)跨膜受體參與LPS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，LPS受體識(shí)別的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)呈多樣性。多個(gè)不同受體分子或受體復(fù)合物在細(xì)胞膜脂質(zhì)層上共同形成一個(gè)LPS受體簇，啟動(dòng)

9、LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞在受到LPS誘導(dǎo)刺激后，自身的機(jī)構(gòu)和功能發(fā)生改變，并導(dǎo)致相應(yīng)的合成和分泌功能發(fā)生變化。與正常細(xì)胞相比較，受刺激細(xì)胞表面許多分子的活性部位暴露，一些與病理相關(guān)的分子啟動(dòng)表達(dá)或表達(dá)增高，提示受刺激的細(xì)胞與正常細(xì)胞表面存在著差異的分子，這些分子可能與內(nèi)毒素休克的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，研究LPS刺激后的細(xì)胞膜脂質(zhì)層中的蛋白質(zhì)可能對(duì)LPS致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)具有推動(dòng)作用。
　　 以往的研究大多是在已有的工作基礎(chǔ)上對(duì)少數(shù)幾個(gè)

10、細(xì)胞分子進(jìn)行分析、在理論上推導(dǎo)出對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展可能具有重要意義的分子，進(jìn)而進(jìn)行深入細(xì)致的功能研究。這是一種傳統(tǒng)的研究策略，其優(yōu)點(diǎn)是研究問題集中，容易深入，可以比較透徹地回答一個(gè)點(diǎn)上的問題，但是若將這個(gè)結(jié)果放到一個(gè)體系層面上，其功能又變得撲簌迷離，這是由“分析”主導(dǎo)的研究手段的局限所導(dǎo)致的，只有當(dāng)這種“點(diǎn)”的結(jié)果積累得足夠多的時(shí)候，體系的問題也會(huì)變得逐漸清晰起來，但這個(gè)過程一般需要長時(shí)間的積累。隨著人類基因組計(jì)劃(human genomi

11、c project，HGP)的完成、蛋白質(zhì)組學(xué)的理論系統(tǒng)和技術(shù)方法已成為后基因組時(shí)代的主旋律。這為我們從另一個(gè)角度，采用“綜合”的研究手段，用系統(tǒng)的觀點(diǎn)來研究問題提供了機(jī)遇。本課題在體系的角度上提出問題，擬應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法進(jìn)行研究。
　　 由于蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有大規(guī)模、高通量、高靈敏度的特點(diǎn)，因此可以有效分析細(xì)胞內(nèi)的整體蛋白質(zhì)。然而整個(gè)細(xì)胞或組織的蛋白組成極其復(fù)雜，直接對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，往往會(huì)丟掉很多蛋白質(zhì)信息，由此衍

12、生出了亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)。亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組就是利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)來分析一種組織或細(xì)胞的某一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的蛋白質(zhì)組成，它一方面可以降低樣品的復(fù)雜度，使分析簡單化；另一方面可以相對(duì)富集相應(yīng)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低豐度蛋白，并且可以部分提示蛋白質(zhì)的定位和功能信息。國外已有亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組方面的研究報(bào)道，并向縱深發(fā)展，出現(xiàn)了亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)組和復(fù)合體蛋白質(zhì)組；但目前關(guān)于內(nèi)毒素休克過程中肝臟細(xì)胞膜蛋白的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究國內(nèi)外未見報(bào)道。
　　 細(xì)胞質(zhì)膜

13、作為細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)、能量和信息交流的場(chǎng)所，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。膜蛋白行使著獨(dú)特的、聯(lián)系生物膜內(nèi)外環(huán)境的功能，如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞問相互作用、細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室化作用、離子和溶質(zhì)的傳輸、能量產(chǎn)生等。因此膜蛋白被認(rèn)為是細(xì)胞的“門鈴”與“門戶”，也是許多藥物的作用靶標(biāo)。據(jù)估計(jì)，膜蛋白只占人類基因編碼蛋白質(zhì)的20％～30％，但是在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的藥靶中大約有70％是質(zhì)膜蛋白質(zhì)；而且最近一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)表明僅作用靶點(diǎn)為1型或2型G蛋白受

14、體的藥物就占所有藥物的70％。
　　 根據(jù)上述思考，我們利用LPS來制作內(nèi)毒素休克BALB/c小鼠模型，提取正常組和LPS刺激3 hr后的小鼠肝臟的細(xì)胞質(zhì)膜蛋白來進(jìn)行研究。我們采用差速離心結(jié)合蔗糖密度梯度離心提取和純化了正常對(duì)照組和LPS刺激后3 hr組小鼠肝臟的細(xì)胞膜，分別采用雙向熒光差異凝膠電泳(two-dimensional difference gelelectrophoresis，2D-DIGE)和二維高效液相色譜(t

15、wo dimensional high performanceliquid chromatograph，2D-HPLC)對(duì)兩組肝臟細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行分離，并建立了相應(yīng)的差異蛋白圖譜。
　　 根據(jù)2D-DIGE的差異圖譜，在LPS刺激3 hr組和正常對(duì)照組間我們找到了19個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中上調(diào)的有13個(gè)，下調(diào)的有6個(gè)。在二維高效液相色譜的差異圖譜中，找到了24個(gè)差異點(diǎn)，其中上調(diào)的有16個(gè)，下調(diào)的有8個(gè)。將上述差異蛋白點(diǎn)取出，進(jìn)行質(zhì)譜(

16、mass spectrum，MS)酶解樣品制備，使用ABI4800MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。通過mascot軟件檢索SWISSPROT數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白。去除角蛋白的污染及鑒定相同的蛋白后，共鑒定出33個(gè)蛋白。通過2D-DIGE分離得到的差異蛋白中，LPS刺激3hr組與正常組比較，表達(dá)上調(diào)的蛋白有：琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)，白蛋白(serum albumin)，ATP合酶α亞基(ATP

17、symhase subunitα)，細(xì)胞色素還原酶亞基1(cytochrome b-clcomplex subunit1)，丙酮酸羧化酶(pyruate carboxylase)，熱休克蛋白70(heatshock protein70 kDa protein1B)，harmartin，副清蛋白α(paralbumin alpha)，視黃醇脫氫酶11(retinol dehydrogenase11)，皮質(zhì)激素2(cortexin-2)，醛

18、脫氫酶(aldehyde dehydrogenase)，共11個(gè)蛋白；表達(dá)下調(diào)的蛋白：谷氨酸脫氫酶1(glutamate dehydrogenase1)，danJ homolog subfamily C member13，proteinKIAA024826，共3個(gè)蛋白。通過PF2D得到的差異蛋白中，LPS刺激3 hr組與正常組相比，表達(dá)上調(diào)的蛋白有：多凝血因子缺乏蛋白2(multiple coagulationfactor defici

19、ency protein2)，細(xì)胞色素b5(cytochrome b5)，線粒體輸入內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶亞基(mitochondrial import inner membrane translocase subunit TimB13)，細(xì)胞色素c氧化酶亞基4異構(gòu)體1(cytochrome c oxidase subunit4 isoform1)，ATP合酶α亞基(ATP synthase subunit alpha)，白介素23受體(IL-23

20、 receptor)，ETS相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(ETS-related transcription factor EIf-1)，血清淀粉樣蛋白A1(serum amyloid A1)，細(xì)胞色素c還原酶亞基7(cytochrome b-cl complex subunit7)，pumilio homolog1，protein S100A9，細(xì)胞色素c氧化酶VIb亞基異構(gòu)體1(cytocllrome c oxidase subunit VIb

21、isoform1)，latrophlin-2，促腎上腺皮質(zhì)激素受體(adrenocorticotropic hormone receptor)和culin-4A等15個(gè)蛋白；表達(dá)下調(diào)的蛋白有轉(zhuǎn)位相關(guān)蛋白δ亞基(translocon-associated protein subunit delta)，主要尿蛋白11和8(major urinary proteins11 and8)，組蛋白H4(histone H4)，組蛋白H2A1H型(h

22、istone H2Atype1-H)，組蛋白H2A1F型(histone H2Atype1-F)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(insulin-like growth factor-binding protein5)等6個(gè)蛋白。兩種分離方法鑒定出相同的蛋白只有2個(gè)，分別是ATP合酶α亞基(ATPsynthase subunit alpha)和細(xì)胞色素c還原酶亞基(cytochrome b-cl complexsubunit)。
　　

23、 對(duì)鑒定出的所有33個(gè)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)的功能分析，分別從蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)位置、分子功能、生物學(xué)過程以及代謝和轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上進(jìn)行分析。通過定位分析發(fā)現(xiàn)完全定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的有3個(gè)；既可定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，又可以定位于其它多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的有7個(gè)；預(yù)測(cè)只在其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，但是沒有定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的有23個(gè)。通過定位預(yù)測(cè)分析后，我們又對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的GO(gene ontology)進(jìn)行功能注釋、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(d

24、omain)和模體(motif)的分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)膜差異表達(dá)蛋白質(zhì)涉及分子伴侶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、鈣離子結(jié)合、核苷酸結(jié)合蛋白、抑癌基因等功能。
　　 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)正常組和LPS刺激3 hr組小鼠肝組織中S100A9蛋白的mRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A9的mRNA在LPS刺激3 hr組中表達(dá)上調(diào)，與通過PF2D篩選的結(jié)果一致。
　　 通過研究，我們得到以下結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用透射

25、電子顯微鏡及蛋白免疫印跡兩種方法分別檢測(cè)所提取的細(xì)胞質(zhì)膜的形態(tài)及純度，表明差速離心結(jié)合蔗糖密度梯度離心法是提取肝組織細(xì)胞質(zhì)膜的有效方法。
　　 2.運(yùn)用2D-DIGE和PF2D兩種分離技術(shù)分離了正常和內(nèi)毒素休克BALB/c小鼠(LPS3 hr)的肝臟細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，并建立了相應(yīng)的差異蛋白圖譜。通過相應(yīng)的軟件分析，通過2D-DIGE分離得到了19個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白點(diǎn)，通過PF2D分離得到了24個(gè)差異蛋白組分。
　　

26、3.對(duì)19個(gè)差異蛋白點(diǎn)和24個(gè)差異蛋白組分進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，去除角蛋白污染峰后，共鑒定出33個(gè)蛋白；通過兩種分離方法共同獲得的蛋白只有2個(gè)，分別是ATP合酶α亞基(ATP synthase subunit alpha)和細(xì)胞色素c還原酶亞基(cytochrome b-cl complex subunit)。
　　 4.對(duì)33個(gè)差異蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)完全定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的有3個(gè)，既可定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，又可以定位于其它多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)