NK細(xì)胞活化性受體NKp30配體的鑒定與功能研究.pdf

1、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK)是天然免疫系統(tǒng)中重要的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，在腫瘤免疫監(jiān)視方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。NK細(xì)胞快速殺傷靶細(xì)胞無需預(yù)先免疫，也沒有MHC限制性，NK細(xì)胞的活性依賴其表面組成性表達(dá)的抑制性和活化性受體信號的平衡。自然殺傷性受體(natural cytotoxicity receptors，NCRs)是NK細(xì)胞重要的活化性受體，其成員之一NKp30表達(dá)在所有人NK細(xì)胞表面，在NK細(xì)胞對抗病毒感染細(xì)胞

2、和腫瘤細(xì)胞中扮演重要角色。Galectin-3(簡稱Gal-3)是β半乳糖苷結(jié)合蛋白家族成員之一，其包含兩個(gè)碳水化合物結(jié)合區(qū)域，有較強(qiáng)的β半乳糖親合力，能夠被多種形式的腫瘤細(xì)胞表達(dá)。據(jù)報(bào)道，它可以直接作為免疫調(diào)節(jié)劑去誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的凋亡。盡管如此，它對NK細(xì)胞的影響還是不十分清楚，為此，構(gòu)建和篩選了高效表達(dá)人NKp30胞外段和人IgGFc段嵌合蛋白的CHO細(xì)胞株，并由此獲得有生物活性的可溶性NKp30-Fc蛋白。進(jìn)一步使用人宮頸癌細(xì)胞

3、系，以及宮頸腺癌異種移植的非肥胖性糖尿病和重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠模型對Gal-3分子在NKp30介導(dǎo)的NK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)中的作用進(jìn)行研究。
　　主要取得了以下結(jié)果:
　　1，重組人NK細(xì)胞活化性受體NKp30融合蛋白的制備和功能鑒定。
　　我們構(gòu)建了NKp30受體胞外段融合了人IgG1的Fc段(NKp30-Fc)的表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)的方法進(jìn)行真核表達(dá)，通過G418

4、抗生素加壓篩選成功獲得表達(dá)Kp30-Fc蛋白的細(xì)胞克隆，進(jìn)一步通過有限稀釋法獲得高表達(dá)Kp30-Fc蛋白的細(xì)胞亞克隆。接下來我們采用ELISA方法篩選高分泌可溶性NKp30-Fc蛋白的亞克隆細(xì)胞，并收集其細(xì)胞無血清培養(yǎng)上清，使用親和層析法進(jìn)行可溶性NKp30-Fc蛋白的純化.通過Western blotting方法進(jìn)行純化后鑒定，最終，我們獲得的NKp30-Fc蛋白的純度在90％以上。功能方面，我們通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)可溶性NKp30-F

5、c蛋白能夠結(jié)合NKp30配體陽性的腫瘤細(xì)胞，此外，51Cr同位素釋放實(shí)驗(yàn)也證明了NKp30-Fc蛋白作為拮抗劑能夠削弱NKp30介導(dǎo)的人NK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)。
　　2，腫瘤細(xì)胞分泌的Gal-3作為人NKp30的可溶性抑制配體，在腫瘤逃逸NK細(xì)胞攻擊中起重要作用。
　　我們使用重組的人NK細(xì)胞活化性受體NKp30融合蛋白（NKp30-Fc）和人宮頸癌模型，發(fā)現(xiàn)可溶性NKp30-Fc能夠免疫沉淀腫瘤細(xì)胞來源的Gal-3蛋白，NKp

6、30和Gal-3的相互作用通過表面等離子體共振(surface plasmon resonance簡稱SPR)實(shí)驗(yàn)被進(jìn)一步證明。我們的研究發(fā)現(xiàn)Gal-3以一種可溶形式被腫瘤細(xì)胞分泌，流式細(xì)胞術(shù)證明了可溶的Gal-3能夠特異的結(jié)合NK細(xì)胞，進(jìn)一步生物化學(xué)方法也證明了可溶的Gal-3能夠結(jié)合NK細(xì)胞表面的NKp30分子。功能方面，當(dāng)Gal-3被加入到NK-92與Hela細(xì)胞的共孵育系統(tǒng)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)NKp30介導(dǎo)的，而非NKG2D介導(dǎo)的，NK

7、細(xì)胞表達(dá)CD107a能力和其細(xì)胞毒活性被抑制。若將可溶的Gal-3和NKp30-Fc蛋白預(yù)先孵育，這個(gè)抑制效應(yīng)則被恢復(fù)。此外，51Cr同位素釋放實(shí)驗(yàn)顯示，若Gal-3表達(dá)被下調(diào)(shGal-3)，將增強(qiáng)Hela細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷的敏感性，相反，Gal-3過表達(dá)(exGal-3)的Hela細(xì)胞對于NK細(xì)胞的殺傷將變得不敏感。這些體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在shGal-3-HeLa或exGal-3-HeLa異種移植的，NK細(xì)胞過繼免疫治療后的NOD-S

8、CID鼠模型中被進(jìn)一步證明，表明了體內(nèi)Gal-3能夠強(qiáng)烈對抗人NK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)。
　　終上所述:通過這里描述的方法制備的重組NKp30-Fc分子有足夠的能力結(jié)合NKp30配體陽性的腫瘤細(xì)胞，能夠與NKp30受體的天然，膜結(jié)合形式競爭。這個(gè)工具分子在定義NKp30與其配體的相互作用中具有廣泛應(yīng)用，同時(shí)有助于尋找NKp30受體功能的拮抗劑。此外，我們證明了腫瘤細(xì)胞分泌的Gal-3作為NK細(xì)胞活化性受體NKp30的可溶抑制性配體，能夠