CD86是NK細(xì)胞的激活性受體.pdf

1、天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是天然免疫系統(tǒng)中非常重要的一類細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，它是免疫系統(tǒng)中的第一道防線。NK細(xì)胞是一群特殊的細(xì)胞，它不同于獲得性免疫在發(fā)揮功能的時(shí)候是需要抗體和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的。在哺乳類動(dòng)物受到病毒感染或者腫瘤侵襲的時(shí)候，NK細(xì)胞會(huì)非常迅速地產(chǎn)生反應(yīng)。NK細(xì)胞的活化是由激活性受體和抑制性受體之間的平衡所決定的，如果激活信號(hào)占主導(dǎo)地位NK細(xì)胞就會(huì)被活化，反過(guò)來(lái)如果抑制信號(hào)占主導(dǎo)那么NK細(xì)胞將受到抑制。NKG2D

2、和NKp44是與殺傷腫瘤密切相關(guān)的NK細(xì)胞的激活性受體成員。在NK細(xì)胞的胞漿里有很多溶細(xì)胞顆粒，當(dāng)NK細(xì)胞活化時(shí)，它們會(huì)釋放到細(xì)胞與細(xì)胞的接觸面。這些顆粒包括溶細(xì)胞的蛋白，比如穿孔素(perforin)和顆粒酶（granzyme），它們?cè)诖偈拱屑?xì)胞的死亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。CD107a又叫做LAMP-1是一種溶酶體相關(guān)的膜蛋白，屬于糖蛋白類，當(dāng)NK細(xì)胞脫顆粒時(shí)，原來(lái)處于管腔膜的CD107a將暴露在細(xì)胞表面的突觸上。Alter等發(fā)現(xiàn)當(dāng)N

3、K細(xì)胞被靶細(xì)胞刺激的時(shí)候CD107a也會(huì)在其細(xì)胞表面檢測(cè)到，因此作為NK發(fā)揮殺傷作用時(shí)候脫顆粒的標(biāo)志物。
　　細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA4)是表達(dá)在激活的T細(xì)胞表面而作負(fù)調(diào)節(jié)其活性的一種抗原。而CTLA4Ig是由人CTLA4胞外區(qū)和人IgG1的重鏈恒定區(qū)組成的融合蛋白。它通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗原遞呈細(xì)胞(APC)上的CD80、CD86分子來(lái)阻礙T細(xì)胞上的CD28同CD80、CD86結(jié)合給T細(xì)胞傳遞共刺激信號(hào)，從而成功誘導(dǎo)T細(xì)胞

4、的耐受。很多對(duì)CTLA4Ig的體外和體內(nèi)的研究表明其能夠治療自身免疫性疾病和控制器官排斥反應(yīng)。CTLA4Ig的商業(yè)化產(chǎn)品Abatacept和Balatacept已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)治療諸如關(guān)節(jié)炎之類的自身免疫性疾病，同時(shí)還可以用于控制移植排斥反應(yīng)。
　　但是，在使用了CTLA4Ig治療的病人中，他們的腫瘤發(fā)生率和感染率并沒(méi)有如預(yù)期的顯著升高，這一點(diǎn)引起了我們的關(guān)注。為什么當(dāng)CTLA4Ig作用于T細(xì)胞，使其活性受到抑制時(shí)，抗腫瘤和抗感

5、染的免疫能力依然維持而沒(méi)有減弱？同時(shí)，已被大家公認(rèn)，在對(duì)腫瘤的監(jiān)視和抗感染中，獲得性免疫和天然免疫系統(tǒng)同時(shí)發(fā)揮著作用，那么是否在這個(gè)過(guò)程中，當(dāng)獲得性免疫被抑制的同時(shí)天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮了作用呢？這一點(diǎn)還有待驗(yàn)證。Grohmann等人發(fā)現(xiàn)CTLA4Ig能夠通過(guò)APC表面的B7分子影響APC的功能。與此同時(shí)，有研究證實(shí)靜息的NK細(xì)胞可以表達(dá)CD86分子，而當(dāng)NK細(xì)胞被激活時(shí)，可以同時(shí)表達(dá)能夠被CTL4Ig結(jié)合的CD80和CD86分子。這些前人的

6、研究結(jié)果促使我們對(duì)探索CTLA4Ig是否能通過(guò)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能從而在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中起到作用產(chǎn)生了興趣。
　　在我們的研究中，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明CTLA4Ig能夠通過(guò)激活NK細(xì)胞增強(qiáng)其殺傷靶細(xì)胞的能力，同時(shí)，也提出了在殺傷靶細(xì)胞的過(guò)程中可能存在的新的分子機(jī)制。我們研究的主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)論總結(jié)如下:
　　一.體內(nèi)試驗(yàn)中CTLA4Ig減少了黑色素瘤B16F0的轉(zhuǎn)移和延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的存活時(shí)間:
　　為了研究CTLA4Ig在

7、腫瘤免疫中的作用，我們采用性別和年齡匹配的B6小鼠作為研究對(duì)象。在第0天尾靜脈接種B16F0細(xì)胞，然后分別在第0天、第3天和第6天尾靜脈注射CTLA4Ig和對(duì)照IgG。以小鼠的生存曲線和其肺部腫瘤的轉(zhuǎn)移數(shù)量為觀察指標(biāo)。結(jié)果表明，CTLA4Ig實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，CTLA4Ig實(shí)驗(yàn)組小鼠肺部腫瘤的轉(zhuǎn)移數(shù)量也明顯少于對(duì)照組。
　　二.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中CTLA4Ig增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞的毒性:
　　1.CTLA4Ig通過(guò)作用

8、于NK細(xì)胞來(lái)減少SCID小鼠體內(nèi)黑色素瘤的轉(zhuǎn)移;
　　已經(jīng)被證實(shí)CTLA4Ig是通過(guò)結(jié)合B7分子從而產(chǎn)生對(duì)獲得性免疫中T細(xì)胞的調(diào)節(jié)，文獻(xiàn)和我們的實(shí)驗(yàn)表明NK細(xì)胞中也表達(dá)B7分子，我們假設(shè)CTLA4Ig可能會(huì)對(duì)NK細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)，而NK細(xì)胞又是腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)有力的效應(yīng)細(xì)胞，我們采用SCID小鼠和B6小鼠作為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CTLA4Ig處理的SCID荷瘤小鼠能夠有效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移;根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)的提示，NK細(xì)胞可能在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到

9、了非常重要的作用。因此，為了進(jìn)一步明確可能存在這種作用，我們又用PK136清除B6小鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞，結(jié)果顯示CTLA4Ig處理組和對(duì)照組腫瘤的轉(zhuǎn)移數(shù)量沒(méi)有明顯差異，這又證明了CTLA4Ig是通過(guò)增強(qiáng)NK細(xì)胞的毒性來(lái)抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　2.CTLA4Ig增強(qiáng)了腫瘤侵潤(rùn)區(qū)域NK細(xì)胞的毒性;
　　為了檢測(cè)在CTLA4Ig作用后NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的變化，在我們的實(shí)驗(yàn)研究中，腫瘤接種后第10天處死小鼠，分離小鼠肺臟的淋巴細(xì)胞，采

10、用磁珠分選技術(shù)純化NK細(xì)胞，測(cè)試其毒性分子的表達(dá)和殺傷靶細(xì)胞能力的強(qiáng)弱。結(jié)果顯示，CTLA4Ig組腫瘤侵潤(rùn)部位的NK細(xì)胞毒性明顯高于IgG對(duì)照組的NK細(xì)胞毒性，因此提示CTLA4Ig能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的毒性來(lái)減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　3.CTLA4Ig能夠提高腫瘤侵潤(rùn)部位NK細(xì)胞的CD107a和perforin的表達(dá);
　　因?yàn)镹K細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志物CD107a和效應(yīng)分子穿孔素是NK細(xì)胞毒性的兩個(gè)重要指標(biāo)。因此，檢測(cè)了腫瘤侵潤(rùn)部位

11、NK細(xì)胞CD107a和perforin的表達(dá)，結(jié)果顯示CTLA4Ig處理組其CD107a和perforin的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。這提示腫瘤侵潤(rùn)部位的NK細(xì)胞可以被CTLA4Ig激活從而顯著提高其殺傷靶細(xì)胞的能力。
　　三、體外實(shí)驗(yàn)中CTLA4Ig能夠提高NK細(xì)胞毒性對(duì)靶細(xì)胞的殺傷;
　　1.在體外CTLA4Ig能夠提高小鼠脾臟NK細(xì)胞毒性對(duì)靶細(xì)胞的殺傷;
　　為了在體外驗(yàn)證CTLA4Ig對(duì)NK細(xì)胞毒性的作用，我們先分離

12、B6小鼠脾臟的NK細(xì)胞，然后用磁珠分選技術(shù)純化NK細(xì)胞，隨后分別和加入了CTLA4Ig與對(duì)照IgG的YAC-1細(xì)胞共培養(yǎng)，然后檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)YAC-1細(xì)胞的殺傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CTLA4Ig實(shí)驗(yàn)組的NK細(xì)胞殺傷YAC-1細(xì)胞的能力比對(duì)照組明顯增強(qiáng)。
　　2.在體外CTLA4Ig能夠提高荷瘤小鼠腫瘤侵潤(rùn)部位NK細(xì)胞的毒性;
　　實(shí)驗(yàn)中取出B6荷瘤小鼠的肺臟，隨后用磁珠分選技術(shù)純化分離肺臟腫瘤侵潤(rùn)的NK細(xì)胞，然后按設(shè)定比例與YAC

13、-1腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)YAC-1的殺傷作用，通過(guò)實(shí)驗(yàn)組CTLA4Ig和對(duì)照組IgG的NK細(xì)胞殺傷作用的比較，結(jié)果顯示CTLA4Ig能夠顯著提高荷瘤小鼠腫瘤侵潤(rùn)部位NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
　　3.在體外CTLA4Ig能夠提高人外周血NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性:
　　通過(guò)分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用磁珠分選技術(shù)純化其NK細(xì)胞，然按設(shè)定比例與K562腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，最后檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)K562的殺傷作用。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組C

14、TLA4Ig和對(duì)照組IgG中NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷，結(jié)果顯示CTLA4Ig能夠顯著提高人外周血NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
　　4.在體外CTLA4Ig能夠顯著提高NK92MI細(xì)胞的細(xì)胞毒性;
　　因?yàn)橥ㄟ^(guò)磁珠分選的方法分離出來(lái)的NK細(xì)胞并沒(méi)有達(dá)到絕對(duì)純化，其他細(xì)胞可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，因此我們采用了人NK92MI這種NK細(xì)胞系，來(lái)進(jìn)一步觀察CTLA4Ig對(duì)NK細(xì)胞毒性的影響。同時(shí)，NK92MI細(xì)胞上幾乎不表達(dá)CD16這種，所以可以

15、進(jìn)一步排除CTLA4Ig中Fc段可能帶來(lái)的ADCC作用的干擾。實(shí)驗(yàn)中，將NK92MI細(xì)胞與靶細(xì)胞K562共培養(yǎng)，通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組CTLA4Ig和對(duì)照組IgG處理的NK92MI細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果顯示CTLA4Ig能夠顯著提高NK92MI的細(xì)胞毒性。
　　四、CD86分子是CTLA4Ig介導(dǎo)的NK細(xì)胞毒性增強(qiáng)的激活性受體;
　　1.NK細(xì)胞上CD86分子的表達(dá)能夠在靶細(xì)胞和細(xì)胞因子刺激的環(huán)境中顯著提高;
　　

16、根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CTLA4Ig能夠高親和力的結(jié)合CD80和CD86分子，我們猜想CTLA4Ig可能是通過(guò)與它們結(jié)合起到增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能從而殺傷腫瘤細(xì)胞的。為了進(jìn)一步明確NK細(xì)胞表面有CD80和CD86的表達(dá)，我們檢測(cè)了在正常生理?xiàng)l件下它們的表達(dá)，流式結(jié)果提示在小鼠脾臟NK細(xì)胞中大約有6％的CD86的表達(dá)，但是沒(méi)有CD80的表達(dá);在體外與YAC-1共培養(yǎng)或者IL-15刺激下的NK細(xì)胞CD86的表達(dá)有顯著提高。另外，我們檢測(cè)了在荷瘤小鼠B1

17、6腫瘤侵潤(rùn)部位的NK細(xì)胞表面CD80和CD86的表達(dá)，結(jié)果提示黑色素瘤B16細(xì)胞能夠顯著提高CD86分子的表達(dá)，CD80的表達(dá)卻沒(méi)有明顯提高。以上結(jié)果提示在腫瘤環(huán)境中NK細(xì)胞能夠顯著提高其表面CD86的表達(dá)。
　　2.CTLA4Ig能夠顯著提高NK細(xì)胞激活性受體NKG2D和NKp44的表達(dá)水平;
　　總所周知，NK細(xì)胞的殺傷功能與其表面的激活性受體有密切的聯(lián)系，同時(shí)NK細(xì)胞在殺傷靶細(xì)胞的過(guò)程中的一條途徑是ADCC作用。為了排

18、除CTLA4Ig可能介導(dǎo)的ADCC作用，同時(shí)為了驗(yàn)證CD86在NK細(xì)胞中的作用，我們采用了NK92MI這種能夠自身高表達(dá)CD86分子的細(xì)胞系作為效應(yīng)細(xì)胞，但同時(shí)其表面無(wú)CD32、CD64的表達(dá)，而只有少量CD16這種低親力FcR的表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，CTLA4Ig能夠顯著提高NK92MI細(xì)胞的激活性受體NKG2D和NKp44的表達(dá)水平。
　　3.CD86可能在增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用里起到類似激活性受體的作用;

19、>　　為了排除抗CD80抗體和抗CD86抗體這兩種封閉性抗體對(duì)NK細(xì)胞毒性的影響，我們將抗CD80抗體和抗CD86抗體分別加入到NK92MI培養(yǎng)體系中，然后檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有顯著變化。然后，我們用抗CD86抗體和CTLA4Ig進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)我們把抗CD86封閉抗體和CTLA4Ig同時(shí)加入到NK92MI和K562腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，然后檢測(cè)NK92MI細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)其殺傷作用與對(duì)照組

20、有部分減弱;當(dāng)我們把抗CD86封閉抗體提前CTLA4Ig2小時(shí)加入NK92MI和K562腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，目的先讓抗CD86封閉抗體先占據(jù)CD86分子結(jié)合位點(diǎn)，然后檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)由CTLA4Ig產(chǎn)生使NK細(xì)胞毒性增強(qiáng)的作用被逆轉(zhuǎn)了。這些結(jié)果提示，CD86可能在CTLA4Ig增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤毒性的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。
　　總結(jié):我們驗(yàn)證了CTLA4Ig能夠顯著減少B16腫瘤的轉(zhuǎn)移以及延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間

21、;同時(shí)觀察到在清除了NK細(xì)胞的小鼠注射CTLA4Ig后，并沒(méi)有改善腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;在體內(nèi)CTLA4Ig作用后能夠顯著提高NK細(xì)胞毒性相關(guān)的CD107a和perforin的表達(dá)。另外，我們?cè)隗w內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了在腫瘤環(huán)境的刺激下，NK細(xì)胞能夠提高CD86分子的表達(dá);高表達(dá)CD86分子的人NK細(xì)胞系，體外實(shí)驗(yàn)在CTLA4Ig的作用下能明顯增強(qiáng)其殺傷靶細(xì)胞的能力。最后我們用抗體封閉實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了CTLA4Ig可能是通過(guò)CD86分子起到使NK細(xì)胞毒