NK細胞活化受體CD226的表達及功能研究.pdf

1、固有免疫系統(tǒng)作為機體抵御外來微生物抗原入侵的第一道防線，能直接迅速的活化并對入侵機體的病原體進行清除，在獲得性免疫系統(tǒng)啟動之前發(fā)揮了重要的屏障作用。天然殺傷細胞(natural killer cells，NK)是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機體防御感染和癌癥的免疫應(yīng)答中起著重要作用。NK細胞的活化受到活化性與抑制性受體的共同調(diào)控，由于識別機制的多樣化，近年來，NK細胞表面活化性受體得到了人們的廣泛關(guān)注。 CD226分子是NK

2、細胞表面活化性受體，近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD226在NK細胞的活化并殺傷腫瘤細胞等生物學(xué)過程中發(fā)揮了重要作用，并與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。雖然CD226的功能得到了人們的廣泛關(guān)注，但其分子識別與活化機制仍然不是非常清楚。 本實驗中，我們構(gòu)建了CD226的胞外不同的結(jié)構(gòu)域蛋白，包括含有N端19-129氨基酸序列的IgⅤ樣結(jié)構(gòu)域ECD1(extracellular domain1)，以及含有兩個IgⅤ樣結(jié)構(gòu)域ECD2(extracell

3、ular domain2)(19-243aa)。通過對兩個長度不同的結(jié)構(gòu)域與腫瘤細胞表面配體蛋白的相互作用進行研究，發(fā)現(xiàn)CD226蛋白與其配體可能的作用位點與其在腫瘤識別殺傷中的作用機理；進一步通過抗體介導(dǎo)的活化與蛋白阻斷實驗，探討了CD226分子在NK細胞活化中的作用機制。 通過上述研究，我們初步獲得了結(jié)果如下： 1.構(gòu)建載體并原核表達CD226分子胞外結(jié)構(gòu)域ECD1與ECD2，重組蛋白經(jīng)復(fù)性純化后，蛋白純度達到95％

4、以上，經(jīng)Western Blot鑒定，蛋白成功表達。成功構(gòu)建表達CD226胞外段蛋白的真核表達載體，經(jīng)過轉(zhuǎn)染并篩選獲得穩(wěn)定高表達可溶性CD226的CHO-K1細胞系。 2.發(fā)現(xiàn)CD226分子在NK細胞對腫瘤細胞識別殺傷中發(fā)揮重要作用，并且CD226分子與配體的識別與結(jié)合主要是通過胞外N端第一個結(jié)構(gòu)域ECD1。蛋白結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)，CD226胞外結(jié)構(gòu)域可以識別并結(jié)合腫瘤細胞表面配體，單獨的ECD1蛋白即可有效與靶細胞結(jié)合。CD226胞

5、外結(jié)構(gòu)域重組蛋白的加入可以有效阻斷NK細胞對腫瘤細胞的殺傷，進一步研究發(fā)現(xiàn)，重組蛋白對效應(yīng)細胞與靶細胞生長與增殖沒有明顯的影響，重組蛋白對殺傷的阻斷主要是通過阻斷NK細胞與靶細胞的結(jié)合實現(xiàn)的，提示CD226在NK細胞對靶細胞的識別中可能發(fā)揮了粘附分子的作用。 3.除粘附作用外，CD226傳遞的活化信號對NK細胞的活化有著重要的影響。抗體刺激CD226分子活化后可以引起NK細胞表面活化分子CD69的表達升高，細胞因子(IFNγ)與

6、殺傷顆粒(CD107a，Granzyme B)的表達都明顯升高。重組蛋白可以有效阻斷K562引起的NK細胞的活化，包括CD69與顆粒酶B的表達降低，ERK1/2的磷酸化程度也有一定程度的降低。上述結(jié)果證明，CD226分子作為NK細胞表面活化性受體，其與配體識別的主要位點位于胞外第一個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域ECD1。CD226分子傳遞的活化信號參與NK細胞與靶細胞的粘附，細胞因子分泌以及殺傷等多種免疫學(xué)過程，ERK1/2分子可能參與了CD22