NK細(xì)胞活化性受體NKp80的融合表達(dá)和功能研究.pdf

1、NK細(xì)胞(Natural Killer Cells，NK Cells)是一群參與機(jī)體天然免疫的重要淋巴細(xì)胞亞群，由于其在殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞中的作用在機(jī)體天然免疫中占有重要位置。NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞以及病毒感染細(xì)胞的殺傷活性主要取決于NK細(xì)胞識別靶細(xì)胞之后所產(chǎn)生的活化性和抑制性信號的整合和輸出，而這兩種信號則分別是由NK細(xì)胞表面活化性受體和抑制性受體及他們所識別的配體所介導(dǎo)的。
　　天然免疫細(xì)胞表面膜蛋白在殺傷細(xì)胞識別腫瘤和病

2、毒感染細(xì)胞的過程中有著至關(guān)重要的作用，而對膜蛋白的識別及殺傷機(jī)制的研究一直是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。NKp80是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的NK細(xì)胞表面活化性受體，也稱為殺傷細(xì)胞凝集素樣受體亞家族F成員1，是二型跨膜糖蛋白，其胞外端包含一個(gè)C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)，與NKG2D同屬于NKC編碼的C型凝集素樣受體家族的一員。NKp80以分子量為80kD的二聚體形式主要表達(dá)于幾乎所有人的NK細(xì)胞表面以及一部分效應(yīng)記憶性的CD8+T細(xì)胞，能激活NK

3、細(xì)胞毒效應(yīng)和細(xì)胞因子的釋放，并且能夠與其他活化性受體協(xié)同作用誘導(dǎo)NK細(xì)胞的活化。NKp80存在的已證實(shí)的唯一配體AICL是活化誘導(dǎo)的C型凝集素的簡稱，同樣也被稱作CLEC2B，其作為髓樣特異性的活化性受體表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些非造血細(xì)胞上。AICL與NKp80的相互作用被證實(shí)不僅能促進(jìn)NK細(xì)胞對惡性的骨髓細(xì)胞的細(xì)胞毒性反應(yīng)，而且還能促使NK細(xì)胞和單核細(xì)胞的共同活化。
　　在我們的研究中，主要獲得的結(jié)果包括以下兩個(gè)部

4、分:
　　1.NKp80分子參與NK細(xì)胞活化并增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤功能
　　NK細(xì)胞的活化及對靶細(xì)胞的裂解主要依賴于其表面存在的大量自然殺傷性受體(Natural Cytotoxicity Receptors，NCRs)和NKG2D分子，但是NK細(xì)胞同樣受其他一些活化性或者共刺激性受體所調(diào)控。在這部分研究中我們發(fā)現(xiàn)，NKp80作為NK細(xì)胞的活化性受體，主要表達(dá)在人源的NK細(xì)胞上而不表達(dá)于人NK細(xì)胞系中。通過NKp80抗體介導(dǎo)N

5、Kp80受體進(jìn)行交聯(lián)后NK細(xì)胞上活化性標(biāo)志分子CD69的表達(dá)顯著上調(diào)，而再導(dǎo)向殺傷實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明了NKp80的交聯(lián)會強(qiáng)烈活化NK細(xì)胞，表現(xiàn)為脫顆?；钚院蜌钚缘娘@著增加，這種活化的水平甚至與經(jīng)典的NK細(xì)胞活化性受體如NCRs和NKG2D等分子所引起的活化水平相當(dāng)。NKp80與其他活化性受體分子共同交聯(lián)時(shí)還能表現(xiàn)出協(xié)同活化NK細(xì)胞的作用。另外通過對NK細(xì)胞殺傷功能的檢測也證明了NKp80的交聯(lián)能顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。細(xì)胞結(jié)合

6、實(shí)驗(yàn)證明了NKp80能特異性結(jié)合白血病細(xì)胞上的AICL分子。通過AICL抗體以及AICL肽段特異性阻斷NKp80-AICL相互作用之后觀察到NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間結(jié)合形成率受到明顯抑制，而反過來通過過表達(dá)AICL分子來促進(jìn)NKp80-AICL相互作用又能顯著促進(jìn)兩種細(xì)胞結(jié)合的形成，這些結(jié)果說明NKp80-AICL相互作用參與并促進(jìn)NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞免疫突觸的形成。而進(jìn)一步的殺傷功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不論單獨(dú)阻斷NKp80還是單獨(dú)阻斷AICL分

7、子均能顯著抑制NK細(xì)胞對白血病細(xì)胞的殺傷活性，而同時(shí)聯(lián)合阻斷兩種分子對NK細(xì)胞殺傷能力的抑制作用比單獨(dú)阻斷更為明顯，說明了NKp80-AICL相互作用能促進(jìn)NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能。因此，上述結(jié)果證明了NKp80的交聯(lián)不僅能強(qiáng)烈激發(fā)NK細(xì)胞的活化以及脫顆粒效應(yīng)，而且還能與AICL分子相互作用，通過促進(jìn)NK細(xì)胞與白血病細(xì)胞之間免疫突觸的形成來增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能，從而給我們提示了NKp80-AICL受配體系統(tǒng)能幫助NK細(xì)胞治療白血病

8、的可能性及可行性。
　　2.NKp80-Fc融合蛋白的制備及介導(dǎo)NK細(xì)胞ADCC功能的研究
　　NK細(xì)胞通過Fc受體所介導(dǎo)的效應(yīng)功能在臨床中已得到重要應(yīng)用，比如抗體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC)。AICL作為NKp80分子已被證實(shí)的配體分子高表達(dá)于惡性白血病細(xì)胞表面(如AML或CML)，同時(shí)目前臨床上也缺乏治療性的AICL特異性抗體，基于以上

9、原因我們希望尋找能靶向AICL陽性的白血病細(xì)胞同時(shí)還能誘導(dǎo)NK細(xì)胞對其發(fā)生ADCC作用的一種有效增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤能力的策略，于是我們制備了NKp80-Fc融合蛋白。流式結(jié)果顯示NKp80-Fc融合蛋白能夠特異性結(jié)合白血病細(xì)胞上的AICL分子，細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)則證明了NKp80-Fc融合蛋白能夠通過ADCC效應(yīng)顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞和白血病細(xì)胞之間免疫突觸的形成。在功能實(shí)驗(yàn)中，這一融合蛋白的ADCC功能進(jìn)一步被證實(shí)。細(xì)胞凋亡及后續(xù)的裂解實(shí)驗(yàn)表明N

10、Kp80-Fc融合蛋白不僅能在細(xì)胞結(jié)合形成的早期促進(jìn)NK細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞的凋亡，還能在結(jié)合后續(xù)階段增強(qiáng)NK細(xì)胞脫顆?；钚院蜌籽〖?xì)胞的功能。這種具有雙重功能的融合蛋白通過同時(shí)結(jié)合NK細(xì)胞和白血病細(xì)胞，不僅能特異性靶向腫瘤細(xì)胞，還能通過ADCC功能介導(dǎo)NK細(xì)胞對白血病細(xì)胞行使強(qiáng)烈的殺傷功能。綜上結(jié)果，本文中的研究方法對后續(xù)研究人員探尋分子靶向治療措施提供了很好的借鑒，并且這一融合蛋白也將可能會在白血病的免疫治療方面具有非常廣闊的應(yīng)用前