siRNA阻斷哮喘小鼠樹突細胞共刺激分子CD80、CD86對IL-4的影響.pdf

1、研究背景:
　　 支氣管哮喘(哮喘)是由多種炎性細胞和炎性介質(zhì)參與的氣道慢性炎癥性疾病。哮喘的患病率和病死率在全球呈逐年上升趨勢，哮喘的治療給患者帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘的最有效藥物，但是長期使用激素會導致嚴重的副作用，有些患者病情嚴重，用激素不能很好的控制，少部分患者會出現(xiàn)激素治療無效(激素抵抗型哮喘)，因此我們有必要尋找新的哮喘防治的方法。
　　 哮喘的發(fā)病機制比較復雜，其中最經(jīng)典、最重要的免疫

2、學異常是Th1/Th2細胞失衡，主要表現(xiàn)為Th2型細胞數(shù)量的增多和功能亢進，T細胞在誘導哮喘氣道炎癥反應中起關(guān)鍵的作用。T細胞的活化需要抗原提呈細胞(Antigen PresentingCell，APC)提供的刺激信號，樹突狀細胞(Dendritic Cell，DC)是體內(nèi)最主要的APC，是唯一初始型免疫反應細胞，也是最強大的免疫反應誘導物，它能捕獲并呈遞抗原，啟動和誘導T細胞分化，在平衡免疫激活和免疫耐受中起著重要作用。CD80/CD

3、86是表達于DC表面的共刺激分子，高表達共刺激分子CD80/CD86的成熟DC(mDC)誘導T細胞活化，低表達共刺激分子CD80/CD86的未成熟DC(imDC)抑制T細胞反應，誘導免疫耐受。許多研究發(fā)現(xiàn)DC表面CD80/CD86的表達與Th2細胞反應及哮喘氣道炎癥有著密切的關(guān)系。
　　 RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，普遍存在于真核細胞中，是真核細胞對抗外源基因侵入及自身基因異常表達

4、的一種重要防御機制，具有高特異性、高效性、傳遞性以及時間依賴性等特點。1998年由Fire等首次發(fā)現(xiàn)[11]，以后陸續(xù)有許多國內(nèi)外學者對其進行研究。小分子干擾核糖核酸(siRNA)作為近年研究的熱點，不僅被用作探討細胞基因功能的工具，而且更吸引人的是應用siRNA抑制致病基因的表達，并開發(fā)出治療各類疾病的新型基因藥物。RNAi目前已被廣泛用于抗病毒、抗腫瘤等方面的研究，其應用于樹突細胞和哮喘的防治近年國內(nèi)外均有報道，應用siRNA阻斷哮

5、喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86對T淋巴細胞分化影響的研究目前未見報道。
　　 本研究通過應用siRNA抑制哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86的表達，阻斷T細胞活化的共刺激信號，觀察siRNA是否對哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86表達具有抑制作用，探討siRNA干擾哮喘小鼠DC的CD80、CD86后對Th2型細胞因子IL-4的影響，從而為RNA干擾應用于哮喘治療提供新的靶位，為哮喘的基因治療開辟新

6、的途徑。
　　 研究目的:
　　 第一部分建立一種從小鼠骨髓中分離培養(yǎng)高純度樹突狀細胞(DC)的有效方法，并在體外進行擴增和鑒定。
　　 第二部分應用siRNA阻斷DC表面共刺激分子CD80、CD86的表達，探討siRNA是否對哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86表達具有抑制作用及siRNA干擾哮喘小鼠DC的CD80、CD86后對Th2型細胞因子IL-4的影響。
　　 實驗方法:
　　 1

7、、小鼠骨髓來源樹突狀細胞(DC)的分離、培養(yǎng)、鑒定。
　　 1.1體外分離培養(yǎng)小鼠骨髓DC
　　 健康6-8周齡SPF級BALB/c小鼠，斷頸處死，無菌取出股骨和脛骨，用RMPI-1640培養(yǎng)基反復沖出骨髓，離心棄上清，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，用含10％的FBS的RMPI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種至6孔板，加入rmGM-CSF和rmIL-4，置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后首次全量

8、換液，去除懸浮細胞，補充細胞因子，以后隔日半量換液并補足細胞因子，培養(yǎng)至第7天，收集懸浮細胞，收集前1天加入LPS，可獲得成熟DC(mDC)。
　　 1.2小鼠骨髓DC的鑒定
　　 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況，流式細胞儀檢測DC表面標記的表達。
　　 2、siRNA阻斷哮喘小鼠樹突細胞共刺激分子CD80、CD86對IL-4的影響
　　 健康6-8周齡SPF級BALB/c雌性小鼠20只，隨機分為

9、2組，分別為正常對照組、哮喘模型組，每組10只。哮喘模型組雞卵白蛋白(OVA)抗原溶液腹腔注射致敏，OVA溶液霧化吸入激發(fā)。正常對照組以生理鹽水替代OVA溶液。光鏡下觀察支氣管、肺組織病理變化。分離培養(yǎng)哮喘小鼠骨髓DC，設(shè)計合成CD80、CD86相關(guān)siRNA序列并轉(zhuǎn)染哮喘小鼠DC，熒光定量RT-PCR、流式細胞術(shù)檢測干擾前后DC中CD80、CD86mRNA的表達和表面標記物CD80、CD86蛋白的表達，分離健康小鼠T細胞。將干擾組、未

10、干擾組、轉(zhuǎn)染試劑對照組的DC分別與小鼠T淋巴細胞共培養(yǎng)，ELISA檢測上清液中Th2分泌因子IL-4的含量。
　　 統(tǒng)計方法:
　　 所有數(shù)據(jù)均運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、小鼠骨髓DC的培養(yǎng)、鑒

11、定
　　 小鼠骨髓細胞經(jīng)rm GM-CSF、rm IL-4和LPS誘導培養(yǎng)后獲得的DC具有典型的樹突狀形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測imDC細胞和mDC細胞均可高表達CD11c，達80％以上，mDC細胞的CD80、CD86、MHCⅡ的陽性表達率分別為(73.63±8.01)％、(75.85±11.72)％、(84.17±10.91)％，顯著高于imDC組細胞的(37.53±9.82)％、(38.29±8.76)％、(68.16±11.92

12、)％(P＜0.05)。
　　 2、siRNA阻斷哮喘小鼠樹突細胞共刺激分子CD80、CD86對IL-4的影響siRNA轉(zhuǎn)染小鼠DC后，CD80、CD86mRNA表達水平明顯降低[(2.09±0.46)vs(0.60±0.17)，(3.58±0.20)vs(0.91±0.48)，P＜0.05]，CD80、CD86陽性表達率顯著減低[(82.45±15.80)％vs(30.79±7.07)％，(89.45±10.22)％vs(27.

13、29±6.99)％，P＜0.05]，DC與T淋巴細胞共培養(yǎng)的上清液中IL-4表達水平明顯下降[(150.69±29.50)pg/ml vs(93.04±13.13)pg/ml，P＜0.05]。
　　 實驗結(jié)論:
　　 1、小鼠骨髓細胞經(jīng)GM-CSF、IL-4和LPS誘導培養(yǎng)后，可獲得足量較高純度具有典型形態(tài)特征的DC，為進一步研究DC的功能和特性奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、哮喘小鼠DC高表達CD80、CD86，siR