Hypocretin對NMDA受體介導(dǎo)的藍斑神經(jīng)元胞體樹突去甲腎上腺素遞質(zhì)釋放的增強作用.pdf

1、已經(jīng)知道，hypocretins(orexins)廣泛參與了各種生理功能，如攝食、神經(jīng)內(nèi)分泌、自主活動、藥物成癮以及睡眠、覺醒等。Hypocretin通過兩種G蛋白偶聯(lián)受體Hcrtr1和Hcrtr2發(fā)揮作用，這些受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有不同的分布。藍斑(LocusCoeruleus，LC)神經(jīng)元是hypocretin纖維分布比較密集的區(qū)域，并且主要表達Hcrtr1.Hypocretins對LC神經(jīng)元具有之間的促興奮作用。進一步地，hypoc

2、retins可以促進LC神經(jīng)元軸突末梢的去甲腎上腺素(Noradrenaline，NA)遞質(zhì)的釋放。通常囊泡釋放不僅發(fā)生在軸突末梢，而且還可以發(fā)生在細胞胞體。我們最近的實驗就發(fā)現(xiàn)，LC神經(jīng)元即存在胞體NA釋放。綜上所述，加之已經(jīng)發(fā)現(xiàn)hypocrefin對細胞的主要作用是引起胞內(nèi)鈣離子的升高(這是引起胞體分泌的關(guān)鍵因素)，因此我們推測hypocretins可能對LC神經(jīng)元胞體分泌具有調(diào)節(jié)作用。 興奮性氨基酸，包括NMDA受體介導(dǎo)的

3、神經(jīng)傳遞是LC神經(jīng)元主要的興奮性傳入，并且參與了各種生理功能。最近已有一些文獻在皮層及腹側(cè)背蓋核神經(jīng)元報道了hypocretins與谷氨酸/NMDA存在相互作用。然而，到目前為止，HCRT和NMDA對LC神經(jīng)元的是否也存在相互作用卻未見報道。在本文中，我們首先研究了HCRT或NMDA是否可以引起LC神經(jīng)元的胞體遞質(zhì)分泌；隨后，我們還研究了HCRT是否可以影響NMDA受體介導(dǎo)的胞體分泌。結(jié)果如下： 1.LC神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)

4、特點 根據(jù)形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)特點可以很容易地將LC神經(jīng)元鑒別出來。在小腦腳平面，大鼠LC核團定位于第四腦室兩側(cè)，靠近三叉神經(jīng)中腦核內(nèi)側(cè)。急性分離的LC細胞胞體較大，直徑20-50μm，橢圓形或呈紡錘形，通常有多個突起。大部分胞體較大的LC神經(jīng)元是去甲腎上腺素能的(TH染色陽性)。通過膜片鉗實驗發(fā)現(xiàn)，LC神經(jīng)元平均靜息膜電位為-55.9±0.9mV，平均輸入阻抗為179.8±0.5MΩ(n=21)。所有被記錄的LC神經(jīng)元都有自發(fā)放電

5、特性，頻率為0.5～5Hz，分為兩種放電形式：phasic發(fā)放和tonic發(fā)放。此外，我們在LC神經(jīng)元分別記錄到電壓依賴性全細胞Na+、K+和Ca2+電流。同時，NA對LC神經(jīng)元的電興奮性具有顯著的抑制效應(yīng)。 2.HCRT引起LC神經(jīng)元胞體遞質(zhì)釋放 給予100nMHCRT不能引起LC神經(jīng)元NA分泌信號，而給予相對的高濃度1μMHCRT則可以引起明顯的反應(yīng)。同樣地，HCRT對LC神經(jīng)元的直接電興奮性也有劑量依賴效應(yīng)，即1μ

6、M可以引起反應(yīng)，而100nM則不行。此外，如果提前給予Hcrtr-1受體阻斷劑，1μMHCRT不能引起分泌信號，提示Hcrtr-1受體可能參與介導(dǎo)其作用。當用玻璃電極吹去神經(jīng)元胞體表面的組織，使碳纖電極緊密接觸細胞表面，可以記錄到HCRT引起的單個尖峰發(fā)放(AmperometriSpikes)。另外，給予1μM河豚毒素(TTX)阻斷樹突和軸突末梢的遞質(zhì)釋放，HCRT引起的分泌信號只是減小了大約20％。因此，這些結(jié)果提示HCRT在LC區(qū)域

7、引起的遞質(zhì)分泌信號主要來源于細胞胞體。 3.NMDA引起LC神經(jīng)元胞體遞質(zhì)釋放 給予100μMNMDA可以引起LC神經(jīng)元明顯的分泌反應(yīng)。相反，給予正常的人工腦脊液(ACSF)，則不能引起反應(yīng)。此外，與100μM相比，20μM和1μM引起相對較弱的信號，提示NMDA作用具有劑量依賴效應(yīng)。進一步地，給予NMDA受體阻斷劑可以完全阻斷NMDA的促分泌作用。因此，這些結(jié)果提示NMDA可以在LC胞體樹突區(qū)域引起單胺類物質(zhì)的分泌。

8、 4.HCRT增強LC神經(jīng)元NMDA受體介導(dǎo)的胞體遞質(zhì)分泌 給予100μMNMDA可以顯著引起分泌信號，隨后用100nMHCRT處理5min，再次給予100μMNMDA可引起更大的分泌信號(增加大約40％)。然而，給予對照ACSF則不能影響NMDA受體介導(dǎo)的分泌信號。此外，給予Hcrtr1受體阻斷劑SB334867(1μM)可以完全阻斷HCRT對NMDA作用的增強效應(yīng)。進一步地，在給予TTX處理條件下，100nMHCRT‘

9、仍然能增強NMDA引起的分泌信號，提示HCRT可以參與調(diào)節(jié)NMDA受體介導(dǎo)的胞體分泌信號。另外，給予PKC特異性阻斷劑BISII，HCRT則不能改變NMDA受體介導(dǎo)分泌反應(yīng)；而用PKC的激動劑PMA處理5min則可以模擬HCRT的調(diào)節(jié)作用。最后，作為對照，100nMHCRT并不能變化高鉀引起的分泌反應(yīng)。因此，這些結(jié)果提示HCRT可以增加LC神經(jīng)元NMDA受體介導(dǎo)的胞體遞質(zhì)分泌，并且這一過程依賴于PKC信號途徑。 5.HCRT增強

10、NMDA受體介導(dǎo)的LC神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子濃度升高 本實驗中，當用無鈣外液(含1mMEGTA和200μMCd2+)處理腦片30min后，100μMNMDA和1μM。HCRT均不能引起任何分泌信號，說明NMDA和HCRT在LC神經(jīng)元引起的胞體分泌是鈣依賴性的。 低濃度的HCRT(100nM)不能引起LC神經(jīng)元的鈣濃度升高，而高鉀則可以引起明顯的鈣信號。同樣地，100μMNMDA也能引起顯著的鈣反應(yīng)。當給予100nMHCRT處

11、理5min后，再次給予NMDA可引起更大的反應(yīng)。這種增強效應(yīng)可被SB334867或BISII阻斷，提示這一過程可能依賴于Hertr1受體以及PKC信號途徑。這些結(jié)果與我們的假說一致，即HCRT增強的NMDA受體介導(dǎo)的鈣信號可能參與胞體遞質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)。 綜合上述，本實驗研究發(fā)現(xiàn)HCRT或NMDA均可以引起LC神經(jīng)元的胞體遞質(zhì)分泌。而給予HCRT則可增強NMDA.受體介導(dǎo)的胞體分泌信號。這種增強效應(yīng)隨后可被SB334867或BISI