去甲腎上腺素對腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核神經(jīng)元活動的調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、中樞去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)能系統(tǒng)在多種重要的生理功能中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。腦干中的藍斑核(locus coeruleus，LC)是中樞NA的主要來源。盡管NA能神經(jīng)元的分布主要位于腦干當中，但由這些神經(jīng)元所發(fā)出的纖維廣泛投射至包括脊髓在內(nèi)的整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在中樞的不同腦區(qū)當中，主要存在三種受體，包括α1、α2以及β受體，介導了NA對不同腦區(qū)神經(jīng)元活動及相關(guān)功能的調(diào)控。然而，鑒于其受體種類繁多，并且分布模式以

2、及激活后對神經(jīng)元活動的影響均呈現(xiàn)出多樣性，NA參與不同生理功能的細胞分子機制也十分復雜多樣，并因此引起了廣泛的關(guān)注。
　　腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核(caudal pontine reticular nucleus，PnC)是mPMRF的重要組成部分，PnC中的網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元介導了震驚運動(startle)這一姿勢調(diào)節(jié)運動。已有研究表明，在PnC中微量注射NA可以對大鼠震驚反射運動行為的幅度產(chǎn)生顯著的調(diào)節(jié)作用，據(jù)此我們推測NA可能通過調(diào)控Pn

3、C網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元，參與其介導的中樞運動功能調(diào)節(jié)?；仡櫸墨I，目前尚無NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動調(diào)控機制的報道。因此，本文綜合采用形態(tài)學、全細胞膜片鉗以及神經(jīng)藥理學技術(shù)，在細胞水平系統(tǒng)探索了NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的調(diào)控及機制。主要結(jié)果如下:
　　1.α1以及α2受體共表達于單個PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中，其激活共同介導了NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元全細胞電流活動的影響。
　　為了明確NA作用于PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的電生理效應，

4、我們將其鉗制在-70 mV，觀察短暫(3 min)灌流3μM的NA引起的全細胞電流變化。研究結(jié)果表明，NA(3μM)在一部分PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中誘發(fā)內(nèi)向電流反應(82/135例，60.7％)，而在另一部分PnC神經(jīng)元中誘發(fā)外向電流反應(53/135例，39.3％)。無論是NA誘發(fā)的內(nèi)向(P=0.364，n=6)還是外向(P=0.511，n=6)電流反應，均不受TTX(1μM)的影響，提示突觸后的NA能受體介導了NA的效應。結(jié)合藥理學手

5、段研究后發(fā)現(xiàn)，NA所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應可以被低濃度α1受體阻斷劑prazosin(Pra，0.01μM)部分阻斷(P＜0.05，n=7)，但高濃度的Pra(10μM)使NA在同一神經(jīng)元中反轉(zhuǎn)為引起內(nèi)向外向電流反應。只有同時加入Pra(10μM)以及α2受體阻斷劑yohimbine(Yh，10μM)方可完全阻斷NA(3μM)對該神經(jīng)元全細胞電流的影響(P＜0.01，n=7)。應用同樣方法研究后發(fā)現(xiàn)，NA所誘發(fā)的外向電流反應可以被低濃度α2

6、受體阻斷劑Yh(0.01μM)部分阻斷(P＜0.01，n=6)，但高濃度的Yh(10μM)使NA在同一神經(jīng)元中反轉(zhuǎn)為引起內(nèi)向電流反應。只有同時加入Pra(10μM)以及Yh(10μM)方可完全阻斷NA(3μM)對該神經(jīng)元全細胞電流的影響(P＜0.01，n=6)。上述結(jié)果表明，PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后共表達有α1和α2受體，其激活在電壓鉗鉗制于-70 mV的PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中分別介導了內(nèi)向和外向電流成分，兩者經(jīng)過不同整合后，表現(xiàn)為N

7、A在一部分神經(jīng)元誘發(fā)內(nèi)向電流，而在另一部分誘發(fā)外向電流。與此相一致的是，免疫熒光雙標結(jié)果表明，α1A和α2A受體亞型共表達于PnC中胞體直徑大于35μm的網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中。
　　2.突觸后α1和α2受體的激活，分別增加和抑制同一PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電活動。
　　本實驗中灌流的ACSF中加入了CNQX(10μM)、AP5(20μM)和picrotoxin(100μM)，以阻斷PnC中的主要興奮及抑制性突觸傳遞。在此基礎(chǔ)上，

8、我們于電流鉗模式(I=0)模式，直接記錄PnC網(wǎng)站脊髓神經(jīng)元的放電活動。在該條件下，所有記錄的6例神經(jīng)元均表現(xiàn)出自發(fā)放電活動(平均放電頻率:4.5±1.5 Hz;頻率變化范圍:1.7～11.6 Hz)。ACSF灌流α1受體的激動劑phenylephrine(PE，100μM)顯著增加了PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電頻率(P＜0.05;n=6);而在同一個的神經(jīng)元中，ACSF灌流α2受體的激動劑則顯著降低了PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電頻率(P＜

9、0.05;n=6)。該結(jié)果不僅進一步確認了實驗室前期電壓鉗實驗的結(jié)果，更進一步揭示了PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后α1以及α2受體的激活可以在神經(jīng)元活動層次對神經(jīng)元興奮性分別起到相反的動態(tài)調(diào)節(jié)作用。
　　3.PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后α1和α2受體激活分別偶聯(lián)的離子通道機制。
　　在全細胞膜片鉗電壓鉗條件下，應用緩慢的斜坡電壓(slowramp)刺激(-125 mV～+5mV，dV/dt=+10 mV/s)，我們可以得到α1以及

10、α2受體激動劑在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元上所誘導的凈電流的電流-電壓關(guān)系曲線(I-V relationship curve)。
　　(1)突觸后α1受體的激活，通過開放下游非選擇性陽離子通道調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動。
　　通過分析發(fā)現(xiàn)，應用PE(100μM)激活α1受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-29.1±3.0 mV;n=15)接近于文獻報道的非選擇性陽離子通道電導(nonselective cationicco

11、nductance，NSCC)的平衡電位。并且在測試電壓范圍內(nèi)其I-V曲線均呈現(xiàn)出正向斜率，提示該通道開放介導了α1受體激活對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的興奮性調(diào)控效應。進一步應用離子置換實驗降低胞外Na+濃度(由152.5 mM降至70 mM)不僅顯著降低了α1受體激活后引起的凈電流大小(P＜0.01;152.5 mM Na+:n=40;70 mM Na+:n=11)，α1受體激活所得到的凈電流的平衡電位也符合預期的向更負的方向移動(-42

12、.9±4.2 mV;P＜0.05;152.5 mMNa+:n=15;70mMNa+: n=9)。上述結(jié)果表明，α1受體激活后可以激活NSCC，調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動。文獻報道NSCC主要包含Na+以及K+成分，進一步應用翻轉(zhuǎn)電位以及戈德曼-霍奇金-卡茨方程(Goldman-Hodgkin-Katz equation)計算得出在不同胞外Na+濃度下的Na+/K+通透比例后發(fā)現(xiàn)，在兩種情況下其比例并無顯著差異(P=0.702;n=9)

13、。該結(jié)果表明，α1受體激活后可能僅與NSCC相偶聯(lián)。
　　(2)突觸后α2受體的激活，通過關(guān)閉非選擇性陽離子通道和開放K+通道調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動。
　　激活α2受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-23.5±4.3 mV;n=10)同樣接近于NSCC的平衡電位但略高于激活α1受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-29.1±3.0mV;n=15)。此外，在其中3列神經(jīng)元中，除接近于NSCC平衡電位的交點外，激

14、活α2受體所得到的凈電流同時還存在接近K+平衡電位的交點(mean:-99.3±4.3 mV)。該結(jié)果提示，與α1受體不同，α2受體下游可能同時偶聯(lián)了NSCC以及K+電導。進一步的離子置換實驗表明，胞外Na+濃度由152.5 mM降至70 mM顯著減弱了α2受體激活后所引起的凈電流幅度(P＜0.01;152.5 mM Na+:n=25;70 mM Na+:n=10)。與此同時，胞外Na+濃度由152.5 mM將至70 mM后，α2受體激

15、活后所引起的凈電流在絕大多數(shù)測試的神經(jīng)元(n=6/7)中均呈現(xiàn)出兩個平衡電位:-109.9±4.7 mV(依然接近于K+平衡電位，并且在低Na+條件下出現(xiàn)概率增大)和-28.2±1.0 mV(明顯高于低Na+條件下NSCC平衡電位的期待值，該期待值來自低Na+條件下α1受體激活后的平衡電位，-42.9±4.2mV)。值得注意的是，在剩下的1個神經(jīng)元中，α2受體激活后所引起的凈電流僅呈現(xiàn)出一個平衡電位，-44.0 mV，接近于低Na+條件

16、下NSCC平衡電位的期待值。該結(jié)果表明，α2受體激活偶聯(lián)了K+通道，并且K+通道的活動可能顯著影響在低Na+(70 mM)條件NSCC平衡電位的觀測值，并使其向更正的方向移動。的確，在ACSF中加入K+通道廣譜阻斷劑Ba2+后，α2受體激活后引起的凈電流幅度進一步顯著減少(P＜0.05;70 mM Na+:n=10;1 mM Ba2+:n=6)，并且此時α2受體激活后引起的凈電流平衡電位僅存在一個，-44.7±1.3 mV(n=6)，與

17、上述低Na+條件下NSCC平衡電位的期待值也不在存在顯著差異(P=0.370)。該結(jié)果表明，α2受體激活后可以同時偶聯(lián)K+以及NSCC兩種電導。并且在阻斷鉀離子后計算α2受體偶聯(lián)NSCC的Na+/K+通透比與α1受體所偶聯(lián)NSCC的Na+/K+通透比并不存在顯著差異(P=0.671;α1:n=24;α2:n=6)，進一步說明兩者偶聯(lián)的為同一類NSCC通道。對α2受體激活引起的凈電流I-V關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，其在接近K+平衡電位呈現(xiàn)出正向斜率而