尾加壓素Ⅱ?qū)π难芊瓷浼爸袠猩窠?jīng)元的調(diào)控作用.pdf

1、尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)是20世紀80年代從魚的脊髓尾部下垂體中分離出來的一種“生長抑素”樣環(huán)肽。研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存在一種孤立的G蛋白偶聯(lián)受體(G-proteincoupledreceptor)GPR14，是UⅡ的特異性受體，主要分布于心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。UⅡ與心肌細胞上此受體結(jié)合后使細胞內(nèi)的Ca2+濃度增加，引起一系列的心血管效應(yīng)。UⅡ是迄今所知最強的縮血管物質(zhì)，在兩棲類動物，引起動脈條濃度依賴性收縮反應(yīng)；在哺乳類動物

2、，低濃度時可使動脈條產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性的松弛反應(yīng)，而高濃度時則引起動脈條非內(nèi)皮依賴性收縮反應(yīng)。大劑量UⅡ除引起心動過緩?fù)猓€引起持續(xù)的心輸出量減少。UⅡ除作用于心血管系統(tǒng)外，還具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和滲透壓的作用，并有促細胞增殖效應(yīng)。血漿中UⅡ的水平在高血壓、心衰、糖尿病、腎病等多種疾病狀態(tài)下有所升高。然而，有關(guān)UⅡ如何參與調(diào)節(jié)血壓的心血管反射，特別是對中樞神經(jīng)元的作用如何，目前仍不十分明確，本文主要通過在體和離體的動物實驗，利用循環(huán)生理學(xué)、電生理

3、學(xué)、激光共聚焦顯微鏡、免疫組化等方法，從以下幾個方面進行了研究：(1)采用隔離灌流頸動脈竇區(qū)，記錄動脈血壓變化的方法，觀察UⅡ?qū)⑴c調(diào)節(jié)血壓的重要的心血管反射——動脈壓力感受器反射的影響。(2)采用玻璃微電極細胞外記錄神經(jīng)元單位放電技術(shù)，觀察UⅡ?qū)Υ笫蠛ｑR腦片神經(jīng)元自發(fā)放電的影響，并探討其可能的作用機制。(3)采用玻璃微電極細胞外記錄神經(jīng)元單位放電技術(shù)，觀察UⅡ?qū)Υ笫笙虑鹉X腦片室旁核神經(jīng)元自發(fā)放電的影響，并探討其可能的作用機制。(4)采

4、用Fluo3-AM負載培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，用激光共聚焦法測定單個神經(jīng)元細胞內(nèi)[Ca2+]i的熒光強度，觀察UⅡ?qū)ｑR神經(jīng)元細胞內(nèi)游離的鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響。(5)利用Fos蛋白免疫組化方法，研究側(cè)腦室注射UⅡ?qū)Υ笫笮难芟嚓P(guān)核團中c-fos的表達的影響。 1尾加壓素Ⅱ?qū)Υ笫箢i動脈壓力感受器反射的影響及其機制采用隔離灌流麻醉大鼠頸動脈竇技術(shù)，觀察了尾加壓素Ⅱ?qū)︻i動脈竇壓力感受器反射的影響。其結(jié)果如下：(1)UⅡ(30.

5、0，300.0，3000.0nmol/L)可以劑量依賴性地抑制大鼠頸動脈竇壓力感受性反射，引起壓力感受性反射的功能曲線向右上方移動，曲線斜率分別從0.43±0.01明顯下降到0.38±0.01(P＜0.01)，0.32±0.01(P＜0.01)，0.23±0.01(P＜0.01)，血壓反射性下降的幅度分別從44.00±1.03mmHg減小到37.67±1.21(P＜0.01)，32.50±1.05(P＜0.01),27.83±1.72(

6、P＜0.01)mmHg。閾壓分別從68.81±1.37mmHg升高到73.84±1.51(P＜0.01)，77.19±1.10(P＜0.01)，85.39±1.34(P＜0.01)mmHg；平衡壓上升，飽和壓升高。(2)預(yù)先應(yīng)用L型鈣通道的阻斷劑維拉帕米(10μmol/L)可以部分阻斷UⅡ?qū)用}壓力感受器的抑制作用。(3)預(yù)先應(yīng)用UⅡ的受體阻斷劑BIM-23127(3.0μmol/L)可以完全阻斷UⅡ的作用。(4)預(yù)先灌流NO合酶阻斷劑

7、(NG-nitro-L-argininemethylester,L-NAME)100μmol/L，不能阻斷UⅡ?qū)用}壓力感受器反射的抑制效應(yīng)。以上結(jié)果表明：UⅡ可以抑制頸動脈竇壓力感受反射，此作用是UⅡ與平滑肌細胞膜上UⅡ的受體結(jié)合，通過開放L型鈣通道引起頸動脈竇區(qū)血管收縮而是實現(xiàn)的，與血管內(nèi)皮釋放的NO無關(guān)。 2尾加壓素Ⅱ?qū)Υ笫蠛ｑRCA1區(qū)神經(jīng)元放電的影響應(yīng)用細胞外記錄單位放電技術(shù)，在大鼠海馬腦片上觀察了UⅡ?qū)ｑRCA1區(qū)神經(jīng)

8、元放電的影響。結(jié)果如下：(1)在77個CA1區(qū)神經(jīng)元放電單位給予UⅡ(0.3，3.0，30.0，300.0nmol/L)2min，有63個放電單位(81.8％)放電頻率明顯降低，且呈劑量依賴性；(2)預(yù)先用100μmol/L的GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿灌流7個海馬腦片，6個放電單位放電頻率明顯增加，在此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，放電頻率無明顯變化；(3)預(yù)先用氯通道阻斷劑印防己毒素灌流8個海馬腦片，8個放

9、電單位頻率明顯增加，在此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，其放電頻率無變化；(4)16個放電單位灌流一氧化氮合酶抑制劑L-NAME50μmol/L，有14個單位(87.5％)放電明顯增加，在此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，放電仍被抑制。因此尾加壓素Ⅱ能抑制海馬神經(jīng)元自發(fā)放電，可能通過作用于GABAA受體而加強氯電流有關(guān)。 3尾加壓素Ⅱ?qū)Υ笫笙虑鹉X室旁核神經(jīng)元放電的影響應(yīng)用細胞外記錄單位

10、放電技術(shù)，在大鼠下丘腦腦片上觀察了UⅡ?qū)ο虑鹉X室旁核(paraventricularnucleus，PVN)神經(jīng)元放電的影響。實驗結(jié)果如下：(1)在39個PVN神經(jīng)元放電單位給予尾加壓素Ⅱ(0.3，3.0，30.0，300.0nmol/L，n=39)2min，有32個放電單位(82.05％)放電頻率明顯降低，且呈劑量依賴性；(2)預(yù)先用100μmol/L的GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿灌流7個下丘腦腦片，5個放電單位放電頻率明顯增加，在

11、此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，放電頻率無明顯變化；(3)預(yù)先用氯通道阻斷劑印防己毒素(picrotoxin)灌流12個下丘腦腦片，其放電頻率明顯增加，表現(xiàn)為癲癇樣放電，在此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，11/12(91.67％)放電頻率無變化；(4)12個放電單位灌流一氧化氮合酶抑制劑(NG-nitro-L-argininemethylester，L-NAME)50mol/L，有11個單

12、位11/12(91.67％)放電明顯增加，在此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，放電被抑制。以上結(jié)果提示：尾加壓素Ⅱ能抑制下丘腦室旁核神經(jīng)元自發(fā)放電，可能與其與GABAA受體結(jié)合加強氯電流有關(guān)。 4尾加壓素Ⅱ?qū)ε囵B(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)游離鈣濃度的影響本研究旨在觀察UⅡ?qū)ε囵B(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)游離鈣濃度[Ca2+]i的影響。經(jīng)熒光探針Flou3-AM標記原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元，用激光共聚焦顯微鏡檢測神經(jīng)元

13、內(nèi)[Ca2+]i的熒光強度(fluoresenceintensity,H)，結(jié)果以FI或相對熒光強度(F1/F0％)表示。實驗結(jié)果表明，(1)在正常腦脊液(含鈣1.0mml/L)中，UⅡ3.0，30.0，300.0nmol/L濃度依賴性、時間依賴性地升高細胞內(nèi)鈣濃度，分別升高195.19％(P＜0.001)，218.81％(P＜0.001)，249.29％。(2)在無鈣腦脊液中加入UⅡ(30.0nmol/L)后[Ca2+]i有輕微升高(

14、P＜0.05)，但此升高的程度與UⅡ(30.0nmol/L)在正常腦脊液中所引起的鈣升高有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)；(3)在無鈣的腦脊液(正常腦脊液含3×10-3mmol/LEGTA)中，應(yīng)用細胞內(nèi)三磷酸肌醇(IP3)受體阻斷劑肝素，UⅡ?qū)ι窠?jīng)元內(nèi)鈣濃度無影響(P＞0.05)；(4)UⅡ升高細胞內(nèi)鈣的效應(yīng)可以明顯被其受體阻斷劑BIM-23127阻斷。以上結(jié)果提示，UⅡ可以升高海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)游離鈣濃度，主要與其促進細胞外鈣內(nèi)流

15、有關(guān)，且此效應(yīng)主要由神經(jīng)元細胞膜上UⅡ受體所介導(dǎo)。 5側(cè)腦室注射尾加壓素Ⅱ?qū)Υ笫笮难芟嚓P(guān)核團中c-fos表達的影響利用Fos蛋白免疫組化方法，研究側(cè)腦室注射UⅡ(5μg)，對大鼠心血管相關(guān)核團中c-fos的表達的影響。側(cè)腦室注射UⅡ誘發(fā)腦干的最后區(qū)，孤束核、下丘腦的室旁核、和中腦的腹側(cè)中央灰質(zhì)等多個部位的心血管中樞出現(xiàn)大量Fos蛋白樣免疫反應(yīng)神經(jīng)元(Fos-LI)，UⅡ受體阻斷劑BIM-23127(10μg)可明顯減弱此效應(yīng)。

16、以上結(jié)果表明，UⅡ可興奮腦內(nèi)部分心血管相關(guān)核團的神經(jīng)元，UⅡ受體介導(dǎo)這一效應(yīng)。 結(jié)論1尾加壓素Ⅱ可以抑制頸動脈竇壓力感受反射，此作用是UⅡ與平滑肌細胞膜上UⅡ的受體結(jié)合，通過開放L型鈣通道引起頸動脈竇區(qū)血管收縮而是實現(xiàn)的，與血管內(nèi)皮釋放的NO無關(guān)。 2尾加壓素Ⅱ能抑制海馬神經(jīng)元自發(fā)放電，可能與其與GABAA受體而加強氯電流有關(guān)。 3尾加壓素Ⅱ能抑制下丘腦室旁核神經(jīng)元自發(fā)放電，可能與其與GABAA受體結(jié)合加強氯電流