尾加壓素Ⅱ在SHR大鼠中樞心血管效應(yīng)的機(jī)制研究-活性氧的作用.pdf

1、尾加壓素Ⅱ(UⅡ)的外周心血管效應(yīng)可因動物種屬及解剖部位的差異而表現(xiàn)明顯不同，然而UⅡ的中樞心血管效應(yīng)卻相當(dāng)一致而穩(wěn)定。已知UⅡ可能通過激活交感神經(jīng)系統(tǒng)影響心血管功能，但至今對于UⅡ的中樞機(jī)制尚知之甚少。由于近年研究顯示中樞活性氧可引起交感興奮，因此本課題提出活性氧(ROS)可能中介中樞UⅡ的心血管效應(yīng)的假設(shè)，具體的設(shè)想為UⅡ可能通過激活NADPH氧化酶的途徑引起中樞活性氧水平增高，繼而引起交感興奮和相應(yīng)的心血管效應(yīng)；如果阻斷活性氧對U

2、Ⅱ的介導(dǎo)作用，就可阻斷中樞UⅡ的心血管效應(yīng)。
　　 本課題通過形態(tài)結(jié)合功能、整體結(jié)合分予生物學(xué)等實驗手段研究中樞活性氧在介導(dǎo)UⅡ心血管效應(yīng)中的可能作用，并進(jìn)而探討活性氧介導(dǎo)UⅡ中樞作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，期望從整體和分子水平兩方面對中樞活性氧中介UⅡ心血管效應(yīng)的機(jī)制作較深入的研究。
　　 本課題的研究結(jié)果對于探索治療高血壓的新途徑可能具有潛在的應(yīng)用價值。
　　 本工作首先采用免疫組織化學(xué)方法觀察自發(fā)性高血壓大鼠(SH

3、R)和正常血壓大鼠(WKY)延髓UⅡ受體(UT)的表達(dá)，以明確心血管相關(guān)核團(tuán)UT的表達(dá)特征。結(jié)果顯示，在大鼠延髓頭端腹外側(cè)部(RVLM)和孤束核(NTS)均有UT免疫陽性細(xì)胞表達(dá)。光密度分析的結(jié)果顯示，SHR大鼠的RVLM和NTS的UT陽性細(xì)胞的平均表達(dá)水平顯著高于WKY大鼠(P<0.05)。為進(jìn)一步驗證SHR和WKY大鼠中樞UT的表達(dá)差異，用免疫印跡實驗(Western blot)定量分析UT在延髓腹外側(cè)和下丘腦的表達(dá)，結(jié)果顯示：UT

4、在WKY和SHR大鼠中樞延髓腹外側(cè)和下丘腦均有表達(dá)，且SHR大鼠延髓腹外側(cè)UT表達(dá)的水平高于WKY大鼠(P<0.05)。上述結(jié)果提示，UT在SHR和WKY延髓腹外側(cè)部表達(dá)的差異可能與自發(fā)性高血壓的發(fā)生相關(guān)。為研究UⅡ在中樞的分布，用放射免疫法測定了WKY和SHR大鼠延髓腹外側(cè)、中腦和下丘腦中UⅡ的含量，結(jié)果表明，在延髓腹外側(cè)和中腦，兩組UⅡ含量無明顯差別(p>0.05)；但在下丘腦，SHR大鼠的UⅡ含量明顯高于WKY大鼠(P<0.05)

5、。為明確UT在中樞神經(jīng)細(xì)胞分布的定位，采用免疫熒光雙標(biāo)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡，觀察了UT在RVLM神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果顯示：WKY大鼠和SHR的RVLM區(qū)大多數(shù)神經(jīng)元上都有UT受體的表達(dá)；同時觀察了UT在RVLM膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果顯示，RVLM區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞上無UT受體的表達(dá)。上述結(jié)果表明，在RVLM區(qū)UT主要分布在神經(jīng)元上。
　　 采用側(cè)腦室和微量注射UⅡ的方法觀察UⅡ的心血管效應(yīng)，結(jié)果顯示：在SHR和WKY大鼠，側(cè)腦室微

6、量注射UⅡ，都可引起血壓升高，在SHR升壓效應(yīng)更明顯(p<0.05)。給SHR大鼠預(yù)先注射UⅡ受體的拈抗劑Urantide可阻斷UⅡ的心血管效應(yīng)。單獨注射Urantide血壓在注射后5分鐘(時間點0和5 min)有明顯下降(p<0.05)，結(jié)合上述形態(tài)學(xué)實驗結(jié)果，提示中樞UⅡ在SHR和WKY大鼠的效應(yīng)的差異可能與兩種動物延髓中UT密度的不同相關(guān)，UⅡ受體可能參與自發(fā)性高血壓的病理過程。為明確UⅡ所作用的心血管相關(guān)核團(tuán)，本實驗觀察RVLM

7、微量注射UⅡ的效應(yīng)，結(jié)果顯示：SHR大鼠RVLM微量注射UⅡ可引起血壓明顯升高；預(yù)先給予UⅡ受體的拮抗劑Urantide可阻斷UⅡ的心血管效應(yīng)。結(jié)合上述形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，提示RVLM是UⅡ產(chǎn)生中樞心血管效應(yīng)的重要核團(tuán)，其他腦區(qū)微量注射UⅡ產(chǎn)生的效應(yīng)可能在RVLM進(jìn)行整合。
　　 為了觀察UⅡ的心血管效應(yīng)是否由活性氧介導(dǎo)，在SHR大鼠側(cè)腦室注射UⅡ前先給予SOD類似物Tempol或UⅡ受體拈抗劑Urantide，然后觀察UⅡ引起的血

8、壓變化。結(jié)果顯示：側(cè)腦室單獨注射人工腦脊液(aCSF)組，大鼠的血壓平穩(wěn)，無明顯變化；單獨注射Urantide血壓在注射后5分鐘(時間點0和5 min)有明顯下降(p<0.05)，提示在SHR大鼠UⅡ有內(nèi)源性緊張性作用：側(cè)腦室單獨注射Tempol，血壓略有下降趨勢，但與aCSF組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著意義。側(cè)腦室注射UⅡ可引起血壓顯著升高(p<0.05)，與aCSF組相比，在注射后10、15、20、25、30 min時間點有顯著意義(p

9、<0.05)。預(yù)先給予Urantide或Tempol均可阻斷UⅡ的心血管效應(yīng)。為確定活性氧介導(dǎo)中樞UⅡ心血管效應(yīng)的相關(guān)核團(tuán)，我們進(jìn)一步在SHR大鼠預(yù)先給予Tempol或NADPH酶抑制劑Apocynin，結(jié)果均可阻斷RVLM區(qū)注射UⅡ的心血管效應(yīng)。這一結(jié)果提示，UⅡ在RVLM的升血壓效應(yīng)可能是由活性氧介導(dǎo)的。
　　 采用DHE熒光測定法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察SHR和WKY大鼠RVLM區(qū)ROS的水平。結(jié)果顯示：WKY組紅色熒光陽

10、性細(xì)胞較散在，而SHR組紅色熒光陽性細(xì)胞較多；SHR+UⅡ組紅色熒光陽性細(xì)胞較密集。這一結(jié)果通過酶標(biāo)法定量測定超氧陰離子的方法得到了驗證，這一結(jié)果提示，中樞UⅡ可引起SHR的RVLM區(qū)ROS水平增高。為進(jìn)一步觀察UⅡ的效應(yīng)是否與NADPH氧化酶的激活相關(guān)，用酶標(biāo)法測定SHR和WKY大鼠RVLM區(qū)NADPH氧化酶的活性，結(jié)果顯示：SHR的RVLM區(qū)NADPH氧化酶的活性比WKY大鼠的高(p<0.05)；側(cè)腦室注射UⅡ可引起NADPH氧化酶

11、的活性增高(p<0.05)，NADPH氧化酶抑制劑Apocynin可阻斷UⅡ的效應(yīng)(p<0.05)。上述結(jié)果也支持上面的假設(shè)，即活性氧介導(dǎo)了中樞UⅡ的心血管效應(yīng)。
　　 為進(jìn)一步研究中樞UⅡ的心血管效應(yīng)是否通過激活NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS信號途徑介導(dǎo)，本實驗采用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦的方法觀察了胞膜亞單位gp91phox或胞漿亞單位p47phox與UT在RVLM的神經(jīng)元的共表達(dá)。結(jié)果顯示：胞膜亞單位gp91phox或胞漿亞單

12、位p47phox與UT在RVLM的神經(jīng)元上均有共表達(dá)。這一結(jié)果為UⅡ和NADPH氧化酶的功能聯(lián)系提供了結(jié)構(gòu)上的基礎(chǔ)，提示UⅡ可能通過作用于RVLM的UT，激活NADPH氧化酶而起效應(yīng)。進(jìn)一步采用Real-Time PCR和Western blot方法分別檢測了SHR大鼠延髓腹外側(cè)區(qū)NADPH氧化酶的亞單位gp91phox、P47phoxmRNA和P47phox蛋白磷酸化的水平。結(jié)果觀察到，側(cè)腦室注射UⅡ可增加SHR大鼠延髓腹外側(cè)區(qū)NAD

13、PH氧化酶亞單位gp91phox、P47phox。mRNA的水平。在SHR大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射UⅡ后5分鐘，延髓腹外側(cè)區(qū)p47phox磷酸化蛋白相對總蛋白的比值升高。上述結(jié)果提示，中樞UⅡ可能作用于RVLM的UT，然后促使胞漿亞單位p47phox磷酸化，與膜亞單位gp91等形成有活性的氧化酶，催化超氧陰離子的生成。
　　 綜上所述，本工作提示UⅡ在SHR大鼠的中樞心血管效應(yīng)通過以下途徑介導(dǎo)：UⅡ作用于RVLM的UⅡ受體UT，激活NA