H2S在SHR大鼠中樞心血管效應(yīng)的機制研究：活性氧的作用.pdf

1、硫化氫(Hydrogensulfide,H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后發(fā)現(xiàn)的第三類氣體信號分子。盡管H2S在體內(nèi)有廣泛的生理作用,但其中樞的心血管效應(yīng)及其調(diào)節(jié)機制還知之甚少。研究顯示,H2S可以減少神經(jīng)元活性氧的生成?；钚匝?reactiveoxygenspecies,ROS)是體內(nèi)一系列具有活性的含氧化合物的總稱,NADPH氧化酶在中樞催化活性氧的生成中發(fā)揮了主要的作用。ROS在中樞和外周都對心血管系統(tǒng)有重要的影響

2、,中樞ROS可介導(dǎo)交感興奮所致的心血管效應(yīng)?；谏鲜隼碚?本課題提出中樞H2S可能通過抑制NADPH氧化酶的活性減少活性氧的生成,繼而抑制交感興奮和相應(yīng)的心血管效應(yīng)。本課題通過整體功能實驗和分子實驗等方法,期望對H2S的中樞心血管效應(yīng)機制作較深入的研究。本實驗首先采用免疫組織化學的方法觀察白發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和正常血壓大鼠(WKY)延髓生成H2S的酶CBS的表達,明確心血管相關(guān)核團CBS的表達特征。結(jié)果顯示,在大鼠延髓頭端腹外側(cè)(

3、RVLM)和孤束核(NTS)均有CBS免疫陽性細胞的表達。為測定SHR和WKY大鼠中樞CBS的表達水平,采用免疫印跡實驗(Westernblot)定量分析CBS在延髓腹外側(cè)和下丘腦室旁核的表達,結(jié)果顯示,CBS在SHR和WKY大鼠延髓腹外側(cè)和室旁核都有表達,且17周SHR大鼠延髓腹外側(cè)CBS的表達水平低于WKY大鼠(P＜0.05),8周大鼠CBS在兩個部位的表達均沒有明顯差別。上述結(jié)果提示,內(nèi)源性H2S的生成減少可能與自發(fā)性高血壓的發(fā)生

4、相關(guān)。為觀察CBS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞分布,采用免疫熒光雙標結(jié)合激光共聚焦顯微鏡的方法觀察了CBS在]EVLM區(qū)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的表達,結(jié)果顯示:RVLM區(qū)神經(jīng)元有CBS的表達,膠質(zhì)細胞無CBS的表達,即CBS主要分布在RVLM區(qū)神經(jīng)元上通過側(cè)腦室注射和RVLM區(qū)微量注射的方法我們觀察了H2S的心血管效應(yīng)。在SHR大鼠和WKY大鼠,側(cè)腦室注射CBS的激動劑SAM均可引起血壓的降低和心率的減慢(P＜0.05),低劑量的H2S供體NaHS(

5、2nmol/10μ1、4nmol/10μI)只在SHR大鼠產(chǎn)生降低血壓和減慢心率的心血管效應(yīng)(P＜0.05),在WKY大鼠無明顯作用。而高劑量的NaHS(20nmol/10μ1)則可以引起SHR大鼠血壓升高和心率加快。提示低劑量的H2S在SHR大鼠可以產(chǎn)生降低血壓和心率的心血管效應(yīng)。結(jié)合形態(tài)學的實驗結(jié)果,提示中樞H2S在SHR和WKY大鼠效應(yīng)的差異可能與兩種動物中樞內(nèi)源性H2S的濃度差異有關(guān)。為了進一步明確H2S所作用的心血管相關(guān)核團,

6、我們觀察了RVLM區(qū)微量注射NaHS的效應(yīng),結(jié)果顯示:SHR大鼠RVLM微量注射NaHS(0.4nmol/0.1μ1)可以引起血壓下降(P＜0.05),提示RVLM是H2S產(chǎn)生中樞心血管效應(yīng)的重要核團,其他腦區(qū)相關(guān)核團注射NaHS產(chǎn)生的心血管效應(yīng)可能在RVLM進行整合。為了觀察H2S的心血管效應(yīng)是否通過抑制活性氧的產(chǎn)生引起,我們采用了DHE熒光測定法觀察了SHR和WKY大鼠RVLM區(qū)活性氧的水平。結(jié)果顯示:WKY對照組紅色熒光細胞較為散

7、在,SHR對照組紅色熒光細胞較為密集,而SHR側(cè)腦室注射低劑量NaHS(4nmol/10μ1)組紅色熒光細胞較SHR對照組明顯減少(P＜0.05)。為了進一步驗證上述實驗結(jié)果,我們采用酶標法測定超氧陰離子水平,結(jié)果顯示,SHR對照組大鼠RVLM區(qū)活性氧的水平較WKY大鼠高(P＜0.05),而側(cè)腦室注射低劑量NaHS的SHR大鼠其活性氧水平較SHR對照組減少(P＜0.05)。這一結(jié)果提示,中樞H2S可以引起SHR大鼠RVLM區(qū)ROS水平的

8、減少。為了觀察H2S的效應(yīng)是否通過抑制NADPH氧化酶介導(dǎo),我們采用酶標法測定了不同組SHR和WKY大鼠RVLM區(qū)NADPH氧化酶的活性,結(jié)果顯示:SHR對照組大鼠NADPH氧化酶的活性比WKY大鼠高(P＜0.05);側(cè)腦室注射NaHS可以抑制NADPH氧化酶的活性(P＜0.05),與NADPH氧化酶抑制劑Apocynin產(chǎn)生的結(jié)果相似。上述結(jié)果也支持我們的假設(shè),即中樞H2S的心血管效應(yīng)與活性氧的減少有關(guān)。為進一步觀察H2S的中樞心血管

9、效應(yīng)與NADPH氧化酶的關(guān)系,我們采用Real-TimePCR和Western-blot方法分別檢測了NADPH氧化酶亞單位gp91phox、P47phoxmRNA水平和P47phox的蛋白磷酸化水平。結(jié)果顯示,側(cè)腦室注射低劑量NaHS可以降低延髓腹外側(cè)區(qū)P47phoxmRNA水平,并且P47phox磷酸化蛋白相對總蛋白的比值降低,gp91phoxmRNA水平無明顯變化。上述結(jié)果提示,H2S可以降低RVLM區(qū)P47phox的磷酸化水平,