1、胎盤中11β--HSD2在子癇前期中作用的研究2、H2S對紅細胞攜氧功能的調(diào)控作用機制.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 主要圍繞11β-HSD2在子癇前期發(fā)病機制中的作用進行研究。
　　子癇前期是妊娠期特有的疾病，嚴重影響著母體和胎兒的健康，是導致孕產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病死亡的主要原因之一。目前，針對子癇前期并沒有有效的診斷和治療措施，臨床上最有效的治療方法仍然是提前終止妊娠。胎盤被認為在子癇前期發(fā)病過程中起著至關重要的作用，因為隨著胎盤的娩出，子癇前期的相關癥狀也會隨之消失。但是，胎盤是通過何種機制參

2、與到子癇前期的發(fā)病過程中，尚未完全闡明。近年來，子癇前期二元發(fā)病理論被廣泛接受，即在子癇前期發(fā)病機制的第一階段，由于胎盤發(fā)育不良滋養(yǎng)層細胞侵入能力受損，使胎盤滋養(yǎng)層細胞無法侵入子宮肌蛻膜和子宮螺旋動脈，從而子宮螺旋動脈無法從高阻力，低容量的血管轉變?yōu)榈妥枇?，高容量的血管。由于子宮螺旋動脈重構障礙，胎盤無法得到充足的氧氣和血液供應致使胎盤處于缺血缺氧的不良狀態(tài)。之后，在子癇前期發(fā)病機制的第二階段，胎盤處于缺氧缺血的狀態(tài)下會釋放大量有害的細

3、胞因子進入到母體循環(huán)中，造成母體廣泛的內(nèi)皮功能紊亂，繼而造成母體出現(xiàn)高血壓，蛋白尿等癥狀。
　　糖皮質激素在妊娠期間很多過程如胚胎著床，胎盤胎兒的生長發(fā)育以及胎兒的分娩中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。糖皮質激素可以作用到胎盤、胎兒、胎膜等妊娠期組織。隨著妊娠期的進行，母體和胎兒血液循環(huán)中的糖皮質激素水平都會隨之升高，但母體循環(huán)中的糖皮質激素升高水平是胎兒側的數(shù)倍。如果胎兒暴露在母體過量的糖皮質激素水平之下，會導致胎兒生長發(fā)育不良。胎盤中

4、的11β-HSD2可以將有活性的糖皮質激素轉變?yōu)闊o活性的糖皮質激素，從而可以阻止母體過量的糖皮質激素進入胎兒循環(huán)中。有研究顯示，子癇前期產(chǎn)婦胎盤中的11β-HSD2表達是降低的，糖皮質激素水平是升高的。也有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期SD大鼠皮下注射地塞米松會導致大鼠出現(xiàn)高血壓，蛋白尿等子癇前期相關癥狀。這些研究提示11β-HSD2可能參與到子癇前期的發(fā)病機制當中，但是11β-HSD2是通過何種機制參與到子癇前期的發(fā)病過程中，尚未闡明。由于子癇前期

5、二元發(fā)病理論被廣泛認可，那么，胎盤中11β-HSD2表達異常是否是通過抑制胎盤滋養(yǎng)層細胞侵入功能和促進胎盤釋放有害細胞因子進入母體等過程參與到子癇前期發(fā)病過程中呢？因此，為了探究11β-HSD2在子癇前期發(fā)病機制中的作用，分別在整體動物和離體細胞水平上，進行了相關實驗探索。
　　結果:
　　1、妊娠期間抑制11β-HSD2活性可以導致大鼠產(chǎn)生子癇前期相關癥狀。在大鼠妊娠期間(GD7.5-19.5)皮下注射11β-HSD2抑制

6、劑CBX180μg/d、360μg/d、720μg/d，3種劑量觀察抑制11β-HSD2之后是否會直接導致大鼠出現(xiàn)子癇前期的相關癥狀。結果顯示:(1)CBX皮下注射給藥之后360μg/d和720μg/d兩組胎盤中11β-HSD2蛋白表達減少并且活性受到抑制。(2)CBX皮下注射給藥之后360μg/d和720μg/d兩組妊娠期大鼠出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、腎損害和胎兒生長受限等子癇前期相關癥狀。
　　2、胎盤特異性抑制11β-HSD2活性

7、導致妊娠期大鼠產(chǎn)生子癇前期相關癥狀。由于胎盤在子癇前期的發(fā)病過程中起著至關重要的作用，建立了胎盤特異性抑制11β-HSD2活性的妊娠期大鼠模型。動物實驗分為五組:空白對照組(CON)、CBX180μg/2d、CBX-NPs、CBX-SRC、CBX-CSA。從GD7.5開始尾靜脈給藥處理，每兩天1次持續(xù)到GD19.5。結果顯示:(1)只有帶有胎盤靶向多肽標簽的CBX-CSA組大鼠胎盤中11β-HSD2的蛋白表達和酶活性是減少的。(2)胎盤

8、特異性抑制11β-HSD2之后妊娠期大鼠出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、腎損害和胎兒生長受限等子癇前期相關癥狀。
　　3、妊娠期(GD7.5-19.5)皮下注射地塞米松(DEX)導致大鼠產(chǎn)生高血壓、蛋白尿、腎損害等子癇前期相關癥狀。
　　4、胎盤中11β-HSD2表達及其活性的異?？梢砸种铺ケP滋養(yǎng)層細胞的侵入。PAS、α-actin、CK免疫組化染色結果顯示，360μg/d和720μg/d兩組全身給藥動物模型和CBX-CSA組靶向給藥動

9、物模型胎盤中，滋養(yǎng)層細胞侵入子宮肌蛻膜和子宮螺旋動脈功能受損。
　　5、胎盤中11β-HSD2表達及其活性的異?？梢詫е伦訉m胎盤血流灌注不足。多普勒超聲結果顯示，全身給藥模型中360μg/d和720μg/d兩組妊娠期大鼠中子宮螺旋動脈，胎盤中母體通道，胎兒側臍動脈內(nèi)血流速度均受到抑制。
　　結論:
　　動物模型和離體細胞實驗結果都表明，胎盤中11β-HSD2表達異?？梢詫е绿ケP滋養(yǎng)層細胞侵入功能受損和血管生成因子與抗血

10、管生成因子表達失衡，進而參與到子癇前期的發(fā)生發(fā)展當中。
　　第二部分 主要圍繞H2S對紅細胞攜氧功能的調(diào)節(jié)作用進行研究。
　　H2S是繼NO、CO之后被發(fā)現(xiàn)的第三類氣體信號分子，可以參與調(diào)節(jié)人體很多生理和病理過程。H2S可以參與調(diào)節(jié)血管舒張，血管形成，炎癥反應以及氧化應激等過程。機體是在L-半胱氨酸的相關代謝通路中產(chǎn)生H2S，其介導H2S產(chǎn)生的兩種酶分別是胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)。CSE和C

11、BS兩種酶可以將同型半胱氨酸和胱硫脒代謝產(chǎn)生L-半胱氨酸，在產(chǎn)生L-半胱氨酸的過程中會伴隨著H2S的釋放。CSE與CBS兩種酶在人體心血管系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)之中廣泛表達。有研究顯示，在缺氧應激的環(huán)境下，機體很多組織和細胞如腦、肺、內(nèi)皮細胞、心肌細胞等都會出現(xiàn)H2S生成減少的現(xiàn)象。課題組前期的研究也顯示，胎盤在缺氧的狀態(tài)下，CBS和CSE的蛋白表達降低，H2S的生成也隨之減少。
　　紅細胞是人體血液中最常見的細胞，其主要的生理

12、功能是負責氧氣的運輸。紅細胞可以在肺臟中結合氧氣使細胞內(nèi)血紅蛋白轉變?yōu)檠鹾涎t蛋白，之后紅細胞隨血液流經(jīng)外周組織將血紅蛋白攜帶的氧氣釋放到外周組織之中。氧氣與血紅蛋白的親和性和氧分壓的關系可以用氧離曲線表示。氧氣與血紅蛋白結合為50％時的氧分壓稱之為P50，其可以反應血紅蛋白與氧氣的親和能力。血紅蛋白與氧氣的結合和釋放受到很多因素如pH、溫度、2，3-二磷酸甘油酸(2，3-BPG)的調(diào)節(jié)。2，3-BPG可以變構調(diào)節(jié)血紅蛋白的構象，使其與

13、氧氣親和性降低，利于氧氣的釋放。2，3-BPG是通過紅細胞內(nèi)糖酵解通路產(chǎn)生的1，3-BPG在2，3-二磷酸甘油酸變構酶(bisphosphoglycerate mutase，BPGM)的作用下生成的。2，3-BPG可以被2，3-二磷酸甘油酸磷酸酶降解，但是由于磷酸酶的活性較低，因此2，3-BPG在紅細胞內(nèi)蓄積并發(fā)揮作用。有研究顯示，人體在缺氧的環(huán)境下，紅細胞內(nèi)的2，3-BPG表達升高，使血液在流經(jīng)外周組織時釋放更多的氧氣。也有研究顯示，

14、人體在高海拔缺氧的環(huán)境下，隨著缺氧時間的增加，血清中H2S的水平也隨之減少。那么，H2S是否可以調(diào)節(jié)紅細胞中2，3-BPG的表達進而調(diào)節(jié)紅細胞的攜氧功能呢？為了解決上述問題，設計了相關實驗。
　　結果:
　　1、首先建立了Cse-/-基因敲除小鼠模型，之后收集野生型小鼠和Cse-/-小鼠的紅細胞進行代謝組學的分析，結果顯示，兩組紅細胞有30種差異代謝物，其中Cse-/-小鼠紅細胞中的2，3-BPG水平明顯升高。代謝組的結果提

15、示，H2S的減少可以導致紅細胞中2，3-BPG表達升高。
　　2、為了進一步驗證H2S對紅細胞攜氧功能的調(diào)節(jié)，采用2，3-BPG檢測試劑盒檢測紅細胞中2，3-BPG水平，結果與代謝組分析一致，Cse-/-小鼠紅細胞中的2，3-BPG水平明顯升高。之后，外源性的注射H2S供體GYY4137之后可以逆轉這一現(xiàn)象。同時，通過血氣分析檢測了紅細胞的攜氧功能指標氧離曲線和P50。結果顯示，H2S減少同樣會導致紅細胞氧離曲線右移和P50升高。

16、GYY4317處理Cse-/-小鼠之后可以逆轉這一現(xiàn)象。
　　3、為了探究血清中H2S的來源，建立了Cse-/-基因敲除小鼠與野生型小鼠骨髓移植模型，分為3組:野生型小鼠骨髓移植到野生型小鼠(WT-WT)，野生型小鼠骨髓移植到Cse-/-小鼠(WT-Cse-/-)以及Cse-/-小鼠骨髓移植到野生型小鼠(Cse-/-WT)。結果顯示，紅細胞本身H2S的減少不會導致血清中H2S的改變，然而，外周組織H2S的減少會影響血清中的H2S水

17、平。同時，紅細胞攜氧能力檢測顯示，外周組織H2S減少會導致紅細胞2，3-BPG以及P50升高。GYY4317處理WT-Cse-/-組小鼠之后，可以逆轉2，3-BPG以及P50的升高。
　　4、為了探究H2S對紅細胞的直接作用，離體培養(yǎng)了人和小鼠的紅細胞，應用GYY4137（250μM，500μM）處理之后，檢測紅細胞攜氧功能，結果顯示，H2S可以抑制紅細胞2，3-BPG和P50的水平并導致氧離曲線左移。
　　5、為了探究H2