AP-2α對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響及在重度子癇前期發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、重度子癇前期是妊娠期特有的疾病，是引起孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一。雖然近幾年來關(guān)于它的研究有了更深的認(rèn)識，但其確切的病因至今國內(nèi)外尚未闡明。因此，對于重度子癇前期發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步探討，已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 重度子癇前期的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及到多種因素，目前普遍認(rèn)為:孕早期胎盤淺著床和血管重塑障礙是重度子癇前期發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞正常分化、遷移、侵襲和凋亡是胚胎著床和胎盤形成的重要保障。一旦平衡失調(diào)

2、，將導(dǎo)致孕早期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生過度凋亡，削弱了滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力，從而引起胎盤形成和發(fā)育的畸形，這可能是重度子癇前期發(fā)病的關(guān)鍵因素。因此，本次課題研究以能影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及凋亡生物學(xué)行為的因素作為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討重度子癇前期的發(fā)病機(jī)制。
　　 轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-2α(AP-2α)是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路轉(zhuǎn)錄性調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)，從而參與脊椎動物的生長發(fā)育過程;同時又因?yàn)锳P-2α能影響腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲及細(xì)胞

3、凋亡等功能，所以AP-2α與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展也密切相關(guān)。SchwartZ等發(fā)現(xiàn)在晚期結(jié)腸癌細(xì)胞中，存在AP-2α表達(dá)缺失的現(xiàn)象，當(dāng)采用AP-2α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480時，發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)增加，MMP-9的表達(dá)及活性降低，同時，也發(fā)現(xiàn)AP-2α能使結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲性和致瘤性減弱的現(xiàn)象，這一研究結(jié)果表明，AP-2α是通過調(diào)節(jié)E-cadherin和MMP-9的表達(dá)，在結(jié)腸癌的發(fā)生及癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程中起著

4、重要的調(diào)控作用。胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞類似于腫瘤細(xì)胞，也具有遷移及侵襲等特征，而其侵襲性主要依賴于大量的蛋白水解酶（如:MMP-2、MMP-9等）及細(xì)胞粘附分子（如E-cadherin）等，共同參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解而得以實(shí)現(xiàn)的。那么AP-2僅是否也能通過調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-9及E-cadherin的表達(dá)，而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力，從而可能參與子癇前期的發(fā)病呢？對這一觀點(diǎn)的提出，目前國內(nèi)外尚未見報道。越來越多的關(guān)于COPD和人乳腺癌等的研究發(fā)現(xiàn)，A

5、P-2α能通過調(diào)節(jié)VEGF、P53、p21WAF/CIP、Bcl-2和MnSOD等的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過程。多項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，Bcl-2和Bax異常表達(dá)與子癇前期中滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生過度凋亡有關(guān)，那么滋養(yǎng)細(xì)胞中Bax和Bcl-2是否也受到AP-2α的直接轉(zhuǎn)錄性調(diào)控，從而誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生過度凋亡，對這一觀點(diǎn)的提出，目前國內(nèi)外也未見報道。
　　 本研究采用免疫組化及realtime-PCR的方法檢測AP-2α與Bax、Bcl-2、M

6、MP-9和E-cadherin在重度子癇前期胎盤組織中的表達(dá)，進(jìn)而通過體外培養(yǎng)人絨毛膜癌滋養(yǎng)細(xì)胞株BeWo細(xì)胞，分別瞬時轉(zhuǎn)染及干擾BeWo細(xì)胞中AP-2α的表達(dá)，采用realtime-PCR及Westernblot的方法，從基因及蛋白水平分別檢測AP-2α下游靶基因Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin表達(dá)的變化;同時分別采用MTT方法、Transwell方法及FCM方法檢測AP-2α對BeWo細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡作用的影

7、響，進(jìn)一步分析AP-2α是否通過直接轉(zhuǎn)錄性調(diào)控Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin的表達(dá)，而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡及侵襲力等生物學(xué)功能，從而說明AP-2α及Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin在重度子癇前期的發(fā)病機(jī)制中共同發(fā)揮重要的作用。
　　 第一部分:AP-2α及相關(guān)靶基因在重度子癇前期胎盤組織中的表達(dá)
　　 目的：
　　 本研究通過分析AP-2α及靶基因Bax、Bcl-2、MMP

8、-9和E-cadherin在重度子癇前期組胎盤組織與正常對照組胎盤組織中的定位和表達(dá)的變化，探討AP-2α及其靶基因Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin在子癇前期發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮的作用。
　　 方法：
　　 采用免疫組化的方法，檢測重度子癇前期組胎盤組織及正常對照組胎盤組織中，AP-2α及其靶基因E-cadherin、MMP-9、Bax和Bcl-2的定位及蛋白的相對表達(dá);采用realtime-PCR方法

9、，檢測重度子癇前期組胎盤組織及正常對照組胎盤組織中AP-2α及Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherinmRNA的相對表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組化結(jié)果分析:
　　 (1)AP-2α、Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin蛋白在胎盤組織中，均表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞，其中AP-2α主要表達(dá)于細(xì)胞核，E-cadherin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，MMP-9、Bax和Bcl-2主要

10、表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿。
　　 (2)重度子癇前期組胎盤組織中，AP-2α、Bax及E-cadherin的陽性表達(dá)明顯高于正常對照組(P＜0.05);而Bcl-2和MMP-9在重度子癇前期組胎盤組織中的陽性表達(dá)明顯低于正常對照組(P＜0.05)。
　　 2.realtime-PCR結(jié)果分析:
　　 重度子癇前期組胎盤組織中AP-2α、Bax和E-cadherinmRNA的相對表達(dá)量均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)

11、意義(P＜0.05);而在重度子癇前期組胎盤組織中Bcl-2和MMP-9mRNA的相對表達(dá)量明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 AP-2α及其靶基因Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin可能共同參與子癇前期的病理過程。
　　 第二部分:AP-2α對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、增殖及凋亡作用的研究
　　 目的：
　　 Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadh

12、erin均為轉(zhuǎn)錄因子AP-2α的下游調(diào)控靶基因，根據(jù)第一部分研究結(jié)果提示:重度子癇前期胎盤組織中AP-2α、E-cadherin和Bax的表達(dá)異常增高，MMP-9及Bcl-2的表達(dá)異常降低。因此，本部分研究我們意在進(jìn)一步探討，AP-2α是否通過直接轉(zhuǎn)錄性調(diào)控胎盤組織中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin的表達(dá)，影響滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為，從而誘導(dǎo)子癇前期的發(fā)生及發(fā)展，同時也進(jìn)一步說明AP-2α在子癇前期的發(fā)病中可能起著重要的

13、調(diào)節(jié)作用，為今后治療子癇前期提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人絨毛膜癌滋養(yǎng)細(xì)胞株BeWo細(xì)胞，（BeWo細(xì)胞可替代正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，作為滋養(yǎng)細(xì)胞分化、侵襲及凋亡等生物學(xué)功能研究的模型），構(gòu)建AP-2α真核表達(dá)載體，分別采用AP-2α表達(dá)載體和AP-2αsiRNA瞬時轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞，通過realtime-PCR及Westernblot方法分別檢測BeWo細(xì)胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadhe

14、rinmRNA及蛋白的表達(dá);采用MTT的方法檢測AP-2α是否影響B(tài)eWo細(xì)胞的增殖;通過Transwell小室檢測AP-2α是否影響B(tài)eWo細(xì)胞的侵襲行為，以及采用流式細(xì)胞術(shù)檢測AP-2α是否促進(jìn)BeWo細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 1.構(gòu)建人AP-2α基因真核表達(dá)載體
　　 經(jīng)測序鑒定，pIRES2-EGFP/AP-2α真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　 2.AP-2α質(zhì)粒及AP-2αsiRNA瞬時轉(zhuǎn)染采

15、用pIRES2-EGFP/AP-2α質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞48h，realtime-PCR檢測結(jié)果顯示:與空質(zhì)粒細(xì)胞組及空白細(xì)胞組對比，BeWoAP-2α細(xì)胞組中AP-2αmRNA的表達(dá)顯著增高;采用Westernblot方法檢測轉(zhuǎn)染48h三組BeWo細(xì)胞中AP-2α的蛋白表達(dá)，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示:與空質(zhì)粒細(xì)胞組及空白細(xì)胞組對比，BeWoAP-2α細(xì)胞組中AP-2α的蛋白表達(dá)顯著增加，故以pIRES2-EGFP/AP-2α真核表達(dá)質(zhì)

16、粒轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞48h，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測時間點(diǎn)。采用3個AP-2αsiRNA片段分別轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞96h，realtime-PCR及Westernblot方法分別檢測AP-2α的基因及蛋白的表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示:與空白細(xì)胞組相比，BeWoAP-2αsiRNA1組中AP-2αmRNA及蛋白的表達(dá)降低最為顯著(P＜0.05)，故以轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞96h，AP-2αsiRNA1片段作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾片段。
　　 3.AP-

17、2α對BeWo細(xì)胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin基因及蛋白表達(dá)的影響
　　 AP-2α基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞48h，realtime-PCR及Westernblot方法分別檢測BeWo細(xì)胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin基因及蛋白的表達(dá)，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示:與空白細(xì)胞組及空質(zhì)粒細(xì)胞組對比，BeWoAP-2α細(xì)胞組中Bax及E-cadherinmRNA及蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而

18、Bcl-2及MMP-9mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低。AP-2αsiRNA1轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞96h，realtime-PCR及Westernblot方法分別檢測BeWo細(xì)胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin基因及蛋白的表達(dá)，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示:與空白細(xì)胞組對比，BeWoAP-2αsiRNA1組中Bax及E-cadherinmRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低，而Bcl-2及MMP-9mRNA及蛋白的表達(dá)明顯增高(P＜0.05)

19、。
　　 4.AP-2α對BeWo細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡行為的影響
　　 AP-2α基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞后，采用MTT方法檢測BeWo細(xì)胞增殖率，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染AP-2α質(zhì)粒細(xì)胞組與空質(zhì)粒細(xì)胞組及空白細(xì)胞組對比，無顯著性差異;經(jīng)Transwell小室對BeWo細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量的檢測統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染AP-2α質(zhì)粒細(xì)胞組與空質(zhì)粒細(xì)胞組及空白細(xì)胞組對比，細(xì)胞侵襲的數(shù)量顯著減少。
　　 AP-2α基因

20、真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞后，經(jīng)流式細(xì)胞儀方法檢測細(xì)胞凋亡率，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示:與空質(zhì)粒細(xì)胞組及空白細(xì)胞組對比，轉(zhuǎn)染AP-2α質(zhì)粒細(xì)胞組中細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)。AP-2αsiRNA1轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞后，與空白細(xì)胞組對比，BeWo細(xì)胞凋亡率則顯著降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.構(gòu)建pIRES2-EGFP/AP-2α真核表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)染人絨毛膜癌滋養(yǎng)細(xì)胞株BeWo細(xì)胞;
　　 2

21、.體外研究進(jìn)一步證實(shí)，AP-2α通過轉(zhuǎn)錄性調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞中E-cadherin和MMP-9的表達(dá)，起到抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的作用，為進(jìn)一步闡明滋養(yǎng)細(xì)胞侵入不足與子癇前期發(fā)病的關(guān)系，提供了參考的理論依據(jù)。
　　 3.體外研究進(jìn)一步證實(shí)，AP-2α通過轉(zhuǎn)錄性調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)，起到促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的作用，為進(jìn)一步闡明滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡與子癇前期發(fā)病的關(guān)系，提供了可靠依據(jù)，同時也為子癇前期發(fā)病機(jī)制的研究提供一個新的研究方