合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜在子癇前期發(fā)病中作用的研究.pdf

1、背景和目的:
　　妊娠期高血壓疾病是孕期特有的疾病,發(fā)病率在5％-8%,造成的孕產(chǎn)婦死亡約占妊娠相關(guān)死亡總數(shù)的10%-16%。該病病因不明,治療上唯一確切有效的手段就是終止妊娠。對(duì)PE病因?qū)W的研究已經(jīng)歷了半個(gè)多世紀(jì),近年來(lái)主要集中在血管內(nèi)皮損傷、免疫系統(tǒng)Th1/Th2的失衡、過(guò)氧化物損害以及胎盤(pán)源性不良因子釋放等方面。公認(rèn)的兩階段病因?qū)W說(shuō)認(rèn)為,妊娠早期階段,在遺傳易感性及免疫耐受失調(diào)等多因素作用背景下,滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足,胎盤(pán)淺著床

2、,為該病埋下隱患;妊娠晚期階段:胎盤(pán)源性因子大量異常釋放入母血,引起母體血管內(nèi)皮功能紊亂、全身性炎癥應(yīng)答加強(qiáng),繼而出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等子癇前期癥狀。而隨著妊娠終止,胎盤(pán)娩出,母體PE癥狀及實(shí)驗(yàn)室改變迅速恢復(fù)正常,故有學(xué)者認(rèn)為PE可能是一個(gè)胎盤(pán)源性疾病。
　　正常妊娠晚期時(shí)孕婦全身各系統(tǒng)均會(huì)表現(xiàn)相應(yīng)的變化,其中外周血的 APTT、PT縮短,FIB升高,孕婦機(jī)體處于血液高凝狀態(tài),為預(yù)防分娩出血奠定基礎(chǔ)。血液及凝血系統(tǒng)的這一改變屬于妊娠

3、晚期的生理過(guò)程。而 PE孕婦血液及凝血系統(tǒng)的改變與正常孕婦差異較大,且在發(fā)病的早期階段即出現(xiàn)了這一異常改變。PE的嚴(yán)重并發(fā)癥-HELLP綜合征,臨床上出現(xiàn)血小板減少、溶血、肝酶升高,為該病引起凝血功能損害的重度表型。但迄今為止,PE患者血液及凝血系統(tǒng)的變化規(guī)律、與疾病的嚴(yán)重程度,影響這一病理變化的核心分子及病因機(jī)制尚不明了。既往研究多集中在 PE患者外周血中凝血物質(zhì)的改變,包括促凝物質(zhì)TAT、可溶性纖維蛋白及TM、蛋白C、AT-Ⅲ等指標(biāo)

4、。而臨床輔助檢查的結(jié)果,僅能從現(xiàn)象上提示 PE患者有凝血機(jī)能的變化,其對(duì)疾病的變化影響、嚴(yán)重程度的判定、如何指導(dǎo)臨床診治尚缺乏清晰的思路,且導(dǎo)致PE孕婦血液及凝血功能異常的中心環(huán)節(jié)尚無(wú)合理解釋,因此,有深入研究的必要。
　　近些年,胎盤(pán)形成過(guò)程中的功能狀態(tài)及后續(xù)的胎盤(pán)源性不良因子釋放增加在 PE發(fā)病中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。胎盤(pán)源性不良因子包括類(lèi)花生酸類(lèi)、sFlt-1、合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜(syncytiotrophoblast

5、 microvillous membrane,STBM)、過(guò)氧化物類(lèi)分子等,可能在子癇前期的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。STBM是一種含有合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)及信號(hào)的帶膜囊泡狀結(jié)構(gòu)。正常妊娠孕婦外周血中STBM脫落釋放,發(fā)揮著母胎界面信號(hào)傳導(dǎo)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換作用,它的脫落受滋養(yǎng)細(xì)胞激活和凋亡的影響,不斷順應(yīng)機(jī)體發(fā)生生理或病理的變化。而已有研究觀察到PE患者外周血STBM含量顯著增加,尤其在早發(fā)型PE則更為明顯。體外實(shí)驗(yàn)認(rèn)為STBM可能通過(guò)抑制血管

6、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、破壞其單層分布結(jié)構(gòu)、干擾小動(dòng)脈的舒張功能,調(diào)節(jié)機(jī)體炎性因子釋放和調(diào)控細(xì)胞免疫等多種途徑影響母體免疫系統(tǒng),導(dǎo)致PE的發(fā)生。我課題組前期研究發(fā)現(xiàn),STBM在小鼠體內(nèi)可以誘發(fā)子癇樣改變,成功構(gòu)建了小鼠子癇前期/子癇模型,但尚未進(jìn)一步研究STBM在模型鼠各器官及系統(tǒng)的功能改變。結(jié)合PE孕婦外周血STBM顯著上調(diào)及血液凝血系統(tǒng)變化的客觀證據(jù),我們推測(cè),STBM可能對(duì)孕婦凝血功能產(chǎn)生影響,導(dǎo)致組織器官缺血缺氧、干擾細(xì)胞正常代謝,引起

7、器官功能障礙,最終子癇前期及子癇發(fā)生。但其具體作用模式及途徑有待進(jìn)一步研究。
　　材料和方法:
　　(一)子癇前期孕婦不同孕期凝血功能的變化
　　1.研究對(duì)象第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院常規(guī)產(chǎn)檢并分娩的PE及正常孕婦
　　2.血液的采集用含抗凝劑的真空采血管取孕婦靜脈血,離心得血漿,2小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。
　　3.指標(biāo)檢測(cè)用全自動(dòng)儀測(cè)凝血5項(xiàng)和血小板指標(biāo)。
　　4.數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)運(yùn)用EXCEL及SPSS軟件處

8、理數(shù)據(jù)。
　　(二) STBM上調(diào)對(duì)小鼠凝血功能的影響
　　1.STBM的制備與鑒定取正常孕17天的C57BL/6小鼠,無(wú)菌條件制備STBM、測(cè)蛋白含量、掃描電鏡驗(yàn)證。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組已孕組分為五組,分別是PBS組(P-CTL)、低濃度STBM組(P-S-L)、中濃度組 STBM(P-S-M)、高濃度 STBM組(P-S-H)、高濃度 STBM+肝素組(P-S-H+heprin);未孕組為中濃度STBM組(NP-S-

9、M)。自孕10天起,尾靜脈注射相應(yīng)液體0.2ml/d;P-S-H組、P-S-H+heprin組孕17天時(shí)注射。
　　3.采集小鼠血標(biāo)本麻醉下挖眼取小鼠的血并離心制血漿,取肺臟和腦組織后處死小鼠。將血漿標(biāo)本保存于-20°C,組織用多聚甲醛固定24h后包蠟,常溫保存。
　　4.檢測(cè)凝血五項(xiàng)在全自動(dòng)凝血儀上測(cè)定凝血指標(biāo)(APTT、PT、D-D)。
　　5.檢測(cè)凝血物質(zhì)按照 ELISA試劑要求,分別測(cè)凝血酶復(fù)合物(TAT)、活

10、化蛋白C(APC)、抗凝血酶(AT-III)、凝血調(diào)節(jié)蛋白(TM)、組織因子(TF)及組織因子途徑抑制物(TFPI)六項(xiàng)指標(biāo)。
　　5.孕鼠肺、腦組織的HE染色,在光鏡下進(jìn)行觀察,采集圖像。
　　結(jié)果:
　　(一)子癇前期孕婦不同孕期凝血功能的變化
　　在正常妊娠組、wPE組、sPE組孕婦,晚孕期外周血漿FIB水平均較早孕期顯著升高(P<0.05),APTT均顯著縮短(P<0.05);與正常妊娠、wPE組比較,s

11、PE組孕婦晚孕期TT顯著升高(P<0.05),D-D值顯著升高(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PT無(wú)明顯改變;在正常妊娠、wPE、sPE組孕婦,晚孕期外周血PLT水平均顯著降低(P<0.05), MPV顯著上調(diào)(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PDW、PCT未見(jiàn)明顯改變。
　　(二) STBM上調(diào)對(duì)小鼠凝血功能的影響
　　制備的 STBM總蛋白含量為0.73±0.10mg/ml,掃描電子顯微鏡下可見(jiàn)直徑約200-500

12、nm的囊泡狀結(jié)構(gòu)成團(tuán)簇?fù)?部分發(fā)生融合,符合STBM固有特征。
　　1.小鼠的凝血五項(xiàng)
　　與P-CTL組比較,P-S-M組的APTT縮短(P<0.05),PT縮短(P<0.05),D-D增高不明顯。P-S-L組與NP-S-M組無(wú)明顯變化。
　　2.小鼠各項(xiàng)凝血物質(zhì)比較
　　隨著STBM濃度的升高,TAT、APC、TF、TFPI呈升高趨勢(shì)。與P-CTL組比較, P-S-M組以及 NP-S-M組的 TF/TFPI均

13、顯著升高(P<0.05),P-S-L組變化不明顯。與P-CTL組和 P-S-H+heprin組,P-S-H組的 TAT顯著上調(diào)( P=0.02)、APC也明顯升高(P<0.05)。與P-S-M組對(duì)比,NP-S-M組各值無(wú)明顯變化。
　　3.小鼠血栓形成
　　P-S-H組較之P-CTL組小鼠的肺臟及腦病理切片中,見(jiàn)均質(zhì)紅染無(wú)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)填滿血管內(nèi)腔,考慮透明血栓形成。
　　結(jié)論:
　　1.子癇前期患者的外周血中STB