Orexin神經(jīng)肽和去甲腎上腺素對腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核神經(jīng)元活動調(diào)控的研究.pdf

1、運動是在神經(jīng)系統(tǒng)中多種運動相關(guān)神經(jīng)元精密協(xié)同下完成的一項重要生理功能。其中，腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核(caudal pontine reticular nucleus，PnC)的網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元(reticulospinal neurons)作為重要的“橋梁”，廣泛轉(zhuǎn)接來自皮層、中腦、腦干和小腦的不同運動信息并直接調(diào)控脊髓運動神經(jīng)環(huán)路活動，在中樞多種運動行為中均發(fā)揮重要作用。既往研究表明，損毀PnC會導致軀體姿勢及肌張力調(diào)節(jié)異常，說明PnC可能是中

2、樞介導姿勢及肌張力調(diào)節(jié)的重要腦區(qū)。姿勢及肌張力調(diào)節(jié)受到多種生理功能狀態(tài)的影響。很有意思的是，通過睡眠剝奪影響受試者覺醒狀態(tài)會對其姿勢及肌張力的正常維持造成顯著損害，表明軀體姿勢及肌張力正常調(diào)節(jié)依賴于良好的覺醒狀態(tài)。
　　業(yè)已證實，機體覺醒狀態(tài)的啟動及維持依賴于皮層下多種促覺醒系統(tǒng)的活動。不同覺醒系統(tǒng)間相互聯(lián)系形成復雜網(wǎng)絡，由該網(wǎng)絡發(fā)出的覺醒纖維廣泛支配了整個神經(jīng)系統(tǒng)。其中，運動腦區(qū)同樣受到覺醒纖維的支配，表明代表覺醒信息的覺醒遞質(zhì)

3、可以直接調(diào)控運動腦區(qū)活動，并參與中樞運動行為執(zhí)行。值得注意的是，下丘腦orexin系統(tǒng)的缺陷可以直接導致猝倒(cataplexy)這一機體軀體姿勢及肌張力調(diào)節(jié)障礙的疾病，且LC-NA能系統(tǒng)在猝倒發(fā)作時突然停止活動，表明下丘腦orexin能系統(tǒng)和LC-NA能系統(tǒng)在正常覺醒狀態(tài)下姿勢及肌張力的調(diào)節(jié)中存在重要作用。
　　已有研究表明，下丘腦orexin能系統(tǒng)和腦干LC-NA能系統(tǒng)可以通過不同機制調(diào)控中樞（包括脊髓、外側(cè)前庭核和小腦等）姿

4、勢及肌張力調(diào)節(jié)相關(guān)腦區(qū)的活動，并參與覺醒狀態(tài)下正常姿勢及肌張力的調(diào)節(jié)。既然如此，PnC作為中樞姿勢及肌張力調(diào)節(jié)的重要腦區(qū)是否也受到下丘腦orexin能系統(tǒng)和腦干LC-NA能系統(tǒng)的調(diào)控成為本文的主要關(guān)注點。以往的形態(tài)學研究表明，orexin能以及NA能纖維均在PnC中有豐富的分布，然而該投射的功能目前尚不明確。因此在相關(guān)部分實驗中，我們首先采用westernblot以及免疫組織化學技術(shù)對PnC腦區(qū)中orexin以及NA能受體的分布進行了檢

5、測。在此基礎上進一步采用膜片鉗結(jié)合神經(jīng)藥理學方法觀測比較了orexin和NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元全細胞電流活動的影響并分別揭示了其機制。有意思的是，orexin和NA均能通過直接的突觸后機制調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的活動，表明PnC可能是orexin和NA參與運動功能調(diào)控的重要腦區(qū)。在上述基礎上，本文首先圍繞下丘腦orexin能系統(tǒng)，對其在PnC中的作用進行了系統(tǒng)的研究。我們進一步觀測了orexin對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸傳遞，包括

6、微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory post-synapticcurrent，mEPSC)和微小抑制性突觸后電流(miniature inhibitory post-synaptic current，mIPSC)的影響及機制。在明確orexin對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的突觸前及突觸后調(diào)控效應及機制的基礎上，我們進一步結(jié)合神經(jīng)藥理學和行為學技術(shù)解答了orexin突觸前/后的不同調(diào)控效應如何分別參與了對PnC網(wǎng)狀脊

7、髓神經(jīng)元所介導的聲音震驚反射(acoustic startle response，ASR)這一姿勢控制行為的調(diào)控。
　　本文主要研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　1.Orexin和NA能受體在PnC中的分布。
　　Orexin及NA能纖維分布于PnC中，但其受體表達情況尚不清楚。本文首先采用免疫組織化學及western blot方法，分別對其受體在PnC中的表達進行了檢測。Orexin-2型受體已被證明存在于PnC中。利用免疫熒

8、光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，orexin-1型受體同樣在PnC中存在豐富表達。我們接下來應用western blot技術(shù)對NA能受體的不同亞型在PnC中的分布進行檢測。Western blot結(jié)果表明，NA能不同受體亞型，包括α1A、α1B、α1D、α2A、α2B和α2C受體，在PnC中均有表達。應用免疫酶標的方法，本研究同時對NA能受體在PnC神經(jīng)元中的分布進行了檢測。同樣，上述不同NA能受體亞型均表達于PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中。以上實驗結(jié)果表明，

9、orexin和NA能受體均表達于PnC中，提示orexin和NA可以通過作用于這些受體調(diào)控PnC神經(jīng)元活動。
　　2.Orexin和NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元全細胞電流活動的影響。
　　接下來，通過全細胞膜片鉗技術(shù)并結(jié)合神經(jīng)藥理學手段，我們在根據(jù)形態(tài)(胞體長軸直徑大于35μm)和電生理鑒定的PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中直接觀測比較了orexin和NA對其全細胞電流活動的影響。
　　(1)Orexin在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中誘

10、發(fā)內(nèi)向電流反應。
　　在所有測試的107例PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中，ACSF灌流orexin-A(30-300 nM)均誘導出穩(wěn)定的內(nèi)向電流反應。此外orexin在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應存在明顯的劑量依賴效應:30、100和300 nM的orexin-A所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應幅度分別為29.8±9.1 pA(n=4)、39.8±4.5 pA(n=11)和50.6±5.8 pA(n=11)。該部分結(jié)果表明，orexi

11、n對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的活動存在的興奮性調(diào)節(jié)作用。
　　(2) NA在一部分PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元誘發(fā)內(nèi)向電流反應，在另一部分卻誘發(fā)外向電流反應。
　　采用同樣的方法，我們觀察了NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元全細胞電流的調(diào)控效應。有趣的是，與orexin的作用模式不同，NA(3μM)在一部分(33/51例，64.7％)測試的神經(jīng)元中誘導出內(nèi)向電流反應，而在剩下的(18/51例，35.3％)神經(jīng)元中則誘導出外向電流反應。同時，NA

12、所誘導的內(nèi)向和外向電流反應在(1-10μM)測試濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出穩(wěn)定的劑量依賴效應。在9例對NA表現(xiàn)出內(nèi)向反應的PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中，1、3和10μM NA誘發(fā)的內(nèi)向電流反應幅度分別為-20.8±3.8 pA(n=8)、-34.9±6.2 pA(n=9)和-46.5±7.3 pA(n=7)。而在另外9例對NA表現(xiàn)出外向反應的PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中，1、3和10μM NA引起的外向電流反應幅度分別為21.3±6.4 pA(n=8)、3

13、0.9±6.8 pA(n=9)和34.3±6.7 pA(n=9)。
　　上述結(jié)果表明，orexin和NA均能調(diào)節(jié)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的全細胞電流活動。然而，與orexin的一致興奮性調(diào)節(jié)模式不同，NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動的調(diào)控更為復雜，包括興奮和抑制兩種形式。
　　3.Orexin和NA通過突觸后機制，調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元全細胞電流活動。
　　(1)Orexin通過激活突觸后orexin-1型和orexin-

14、2型受體，在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元誘導出內(nèi)向電流。
　　ACSF中加入TTX(1μM)對orexin所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應的幅度并無顯著影響(n=6，P=0.995)，說明該效應主要由突觸后機制所介導。ACSF中加入orexin-1型受體特異性阻斷劑SB334867(10μM)僅部分阻斷了orexin-A(100 nM)所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應(n=4，P＜0.01)。而在ACSF中加入orexin-1型及orexin-2型受體的聯(lián)合阻斷

15、劑TCS1102(1μM)則可完全阻斷orexin-A(100nM)所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應(n=6，P＜0.01)。上述結(jié)果共同表明，orexin通過激活突觸后orexin-1及orexin-2型受體，對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元進行興奮性調(diào)控。
　　(2)非選擇性陽離子通道(non-selective cation channels，NSCCs)的開放介導了orexin對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的突觸后效應。
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與or

16、exin受體活化相偶聯(lián)的離子通道包括K+通道、Na+-Ca2+交換體以及NSCCs三種。我們首先在加入orexin-A(100 nM)前后，對記錄的PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元進行緩慢的斜坡電壓(slowramp)刺激(范圍:-125～-55 mV，斜率:+10 mVs)，并得到其分別對應的全細胞電流的I-V曲線關(guān)系。在8例測試的神經(jīng)元中，對照與加入orexin-A后的全細胞電流均未出現(xiàn)交點，在5/8例神經(jīng)元中，orexin-A與對照組的全細胞

17、電流呈現(xiàn)出平行狀態(tài);在剩下的3/8例神經(jīng)元中，兩者則隨著刺激電壓的增大而呈現(xiàn)出在大于-55 mV方向的相交趨勢?？紤]到在我們實驗條件下應用能斯特方程(Nernst equation)計算所得的K+平衡電位為-102.3 mV，因此K+通道可能并非介導orexin-A所誘發(fā)內(nèi)向電流的主要成分。進一步擴大斜坡電壓刺激范圍(范圍:-125～+5mV，斜率:+10 mVs)后，我們發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)(9/10例)測試的神經(jīng)元中，orexin-A所誘

18、發(fā)凈電流的平衡電位水平位于-27.2±2.7 mV(n=9)，接近于NSCCs電導的平衡電位水平。在僅有一例測試的神經(jīng)元中，該電流平衡電位為-99.7 mV。該結(jié)果表明，在絕大多數(shù)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中，orexin-A所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應由下游NSCCs的開放所介導，而K+通道可能僅在極少數(shù)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元上參與了orexin-A所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應，并非主要成分。
　　考慮到NSCCs開放通透Na+和K+，我們進一步采用離

19、子置換實驗對上述推論進行了驗證。ACSF中Na+濃度從152.25mM降低至27 mM后，orexin-A(100 nM)在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中所引起的內(nèi)向電流反應幅度顯著減小(n=7，P＜0.01)。進一步在ACSF中加入NSCCs的阻斷劑flufenamic acid(100μM)同樣可以顯著降低orexin-A(100 nM)所引起的內(nèi)向電流反應幅度(n=5，P＜0.01)，而Na+-Ca2+交換體阻斷劑SN-6對orexin-

20、A(100 nM)所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應無顯著影響(n=4，P=0.746)。上述結(jié)果表明，orexin-A在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應主要由NSCCs的開放所介導，而K+通道可能在極少數(shù)神經(jīng)元中參與了這一反應，但并非主要成分。
　　3) NA通過突觸后共表達的α1和α2受體，調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元全細胞電流活動。
　　在闡明了orexin調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元全細胞電流活動的受體及離子通道基礎上，我們進一

21、步對NA在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元發(fā)揮效應的受體和離子機制進行了研究。由于該部分工作與實驗室他人合作共同完成，在此僅詳述我本人完成的受體機制部分工作。
　　結(jié)合藥理學手段我們對NA發(fā)揮前述效應的受體機制分別進行了研究。在7例對NA呈現(xiàn)內(nèi)向反應的PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中，α1受體的特異性阻斷劑prazosin(Pra，0.01μM)部分阻斷了NA(3μM)所引起的內(nèi)向電流反應(n=7，P＜0.05)。該結(jié)果表明，突觸后α1受體參與了NA所

22、誘發(fā)的內(nèi)向電流反應。然而ACSF中加入10μM Pra后，在完全阻斷上述內(nèi)向電流反應的同時，NA在同一神經(jīng)元中誘發(fā)出了穩(wěn)定的外向電流反應（平均幅度:23.5±5.1 pA，n=7）。進一步在ACSF中加入α2受體的特異性阻斷劑yohimbine(Yh，10μM)方可完全阻斷NA在此神經(jīng)元上所引起的反應(P＜0.01)。上述結(jié)果表明，NA在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中所誘發(fā)的整體內(nèi)向電流其實包含有2種成分:一是α1受體激活所產(chǎn)生的內(nèi)向電流成分;

23、二是α2受體激活所產(chǎn)生的外向電流成分。上述兩種成分整合后，表現(xiàn)出NA所引起的內(nèi)向電流反應。
　　在另外6例對NA呈現(xiàn)出外向反應的PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中，Yh(0.1μM)部分阻斷了NA(3μM)所引起的外向電流反應(n=6，P＜0.01)。該結(jié)果表明，突觸后α2受體參與了NA所誘發(fā)的外向電流反應。ACSF中加入10μM Yh后，在完全阻斷上述外向電流反應的同時，NA在同一神經(jīng)元中誘發(fā)出了穩(wěn)定的內(nèi)向電流反應（平均幅度:-13.7±2

24、.3 pA，n=6）。進一步在ACSF中加入Pra(10μM)方可完全阻斷NA在此神經(jīng)元上所引起的反應(P＜0，01)。
　　上述結(jié)果共同表明，α1和α2受體共表達于單個PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中，其激活可以分別產(chǎn)生內(nèi)向及外向電流成分，兩種成分的不同整合介導了NA對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元興奮和抑制性調(diào)控。與此一致，我們的免疫熒光雙標結(jié)果表明，α1A和α2A受體亞型的確共表達于單個PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中。
　　4.Orexin對Pn

25、C網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元mEPSC和mIPSC突觸傳遞的影響及機制。
　　在本部分工作中，我們首先以orexin-A系統(tǒng)為中心，進一步探索了其對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸傳遞影響及機制。通過藥理學手段，我們分離出了代表突觸前興奮性信息自發(fā)釋放的mEPSC和代表突觸前抑制性信息自發(fā)釋放的mIPSC。
　　(1) Orexin抑制PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元mEPSC的頻率，但對mIPSC無顯著影響。
　　在測試的9例PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中

26、，orexin-A(300 nM)既不影響mIPSC的平均頻率(n=9，P=0.469)，也不影響其平均幅度(n=9，P=0.653)，說明orexin-A對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸前抑制性信息釋放并無顯著影響。
　　在另外8例神經(jīng)元中，我們發(fā)現(xiàn)orexin-A(300 nM)可以顯著抑制mEPSC的頻率(n=8，P＜0.01)，但不影響其幅度(n=8，P=0.501)，該結(jié)果表明orexin可以通過突觸前的機制對PnC網(wǎng)狀脊髓神

27、經(jīng)元突觸前興奮性信息釋放進行抑制性調(diào)控。
　　(2) Orexin通過動員內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)，抑制PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元mEPSC的頻率。
　　在ACSF中加入大麻素1型受體(canabinoid type1 receptor, CB1 R)的特異性阻斷劑AM251(1μM)后，上述orexin-A(300 nM)對mEPSC頻率的抑制效應被完全阻斷(n=8，P=0.521)，而mEPSC的幅度仍然不受影響(n=8，P=0.11

28、4)。綜上，該部分結(jié)果證明orexin可以通過動員內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)，通過激活突觸前谷氨酸末梢CB1受體，對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元谷氨酸的釋放進行抑制性調(diào)控。與電生理實驗結(jié)果相一致，我們的免疫熒光結(jié)果表明內(nèi)源性大麻素合成限速酶diacylglycerol lipaseα(DAGLα)在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中均存在豐富的表達。
　　5.Orexin的突觸前抑制效應參與了對CRN功能性傳入(CRN-eEPSCs)的抑制。
　　在上述

29、闡明orexin抑制PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元mEPSC的基礎上，我們進一步想知道該突觸前效應是否在功能活動層次參與了對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元所接收到的功能性興奮傳入的調(diào)控。通過電刺激CRN，我們在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中記錄到了CRN-eEPSCs。在ACSF中灌流orexin-A(300 nM)顯著抑制了刺激所誘發(fā)的eEPSC1的幅度(n=10，P＜0.01)。并且該抑制效應同時伴隨著eEPSC2/eEPSC1比值的增大(n=10，P＜0.0

30、1)，提示orexin-A可以通過突觸前的機制對CRN興奮性信息的傳入進行抑制性調(diào)控。進一步在ACSF中加入AM251(1μM)后，上述orexin-A對eEPSC1幅度的抑制效應幾乎被完全阻斷了(n=6，P=0.203)，同時eEPSC2/eEPSC1比值也不在發(fā)生變化(n=6，P=0.841)。綜上所述，該部分結(jié)果說明，上述orexin對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元mEPSC的抑制效應同樣在功能層次參與了對功能性興奮傳入的抑制性調(diào)控

31、　　6.Orexin對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的突觸后及突觸前調(diào)控效應在行為水平參與了對ASR姿勢控制行為的調(diào)節(jié)。
　　在上述研究發(fā)現(xiàn)基礎上，我們進一步在行為水平觀察了orexin對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元介導的ASR行為的影響。結(jié)果表明，PnC腦區(qū)雙側(cè)微量注射30μM orexin-A在不同聲音刺激強度(94-112 dB)下均顯著增大了ASR反應幅度。這與orexin-A對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后的興奮效應相一致。但PnC腦區(qū)雙側(cè)微

32、量注射3μM orexin-A在較小的94 dB聲音刺激時卻顯著抑制了ASR反應幅度(P＜0.01，n=13)。有意思的是，在注射3μMorexin-A的同時注射AM251(1 mM)阻斷orexin-A對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的突觸前抑制效應后，3μM orexin-A在94 dB時對ASR發(fā)生幅度的抑制效應被完全阻斷。該結(jié)果表明，在orexin-A濃度較低且外界傳入聲音強度較弱時，orexin-A對突觸前興奮信息傳入的抑制效應大于對突

33、觸后的興奮效應，使得其整合后在行為水平表現(xiàn)為抑制ASR反應。與此相一致，我們進一步發(fā)現(xiàn)30μMorexin-A對于ASR的閾值并無顯著影響(n=9，P=0.347);但3μMorexin-A卻顯著增加了ASR發(fā)生的閾值(n=9，P=0.347)。該部分結(jié)果不僅表明orexin-A對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的突觸前、后調(diào)節(jié)效應分別參與了對其幅度和閾值的調(diào)控，同時也提示在不同生理情況下，這兩者在神經(jīng)元活動及行為層次的整合可以促進PnC網(wǎng)狀脊髓神

34、經(jīng)元對較強刺激做出快速有效反應，并同時過濾噪聲傳入信息的影響，進而促進相應運動行為的高效準確執(zhí)行。
　　綜上所述，本文揭示了orexin和NA均可通過直接的突觸后效應對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動進行調(diào)控。其中，orexin通過激活突觸后orexin-1及orexin-2受體，并開放NSCCs對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元進行興奮性調(diào)控。而與orexin不同，NA通過激活共表達與PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后的α1和α2受體，對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)

35、元可以進行興奮或抑制性的雙向調(diào)控。在此基礎上，我們首先系統(tǒng)解答了orexin在PnC中作用的生理意義。Orexin不僅通過突觸后機制對PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元進行興奮性調(diào)控，同時通過動員內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)對其突觸前興奮信息的傳遞進行抑制性調(diào)控。該突觸前/后調(diào)控效應均在行為層次參與了對ASR行為的調(diào)節(jié)。通過上述實驗，我們系統(tǒng)揭示了orexin通過調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動，可以促進機體對較強刺激做出快速有效反應，并同時過濾噪聲傳入信息的影響，