組織因子途徑抑制物-2及其結(jié)構(gòu)域1的基因克隆、表達(dá)和功能研究.pdf

1、組織因子途徑抑制物一2(tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2)，又稱胎盤蛋白一5(placentaprotein-5，PP-5)和基質(zhì)相關(guān)絲氨酸蛋白酶抑制劑(matrixassociatedserineproteaseinhibitor,MSPI)，是一種帶有kunitz型結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員，由于與組織因子途徑抑制物(tissuefactorpathwayinhi

2、bitor,TFPI)的結(jié)構(gòu)非常相似，故此得名。成熟的人TFPI-2(humanTFPI-2，hTFPI-2)由富含酸性氨基酸的N端、串聯(lián)的三個(gè)kunfiz結(jié)構(gòu)域和富含堿性氨基酸的C端組成，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它能抑制胰蛋白酶、纖溶酶、糜蛋白酶、血漿緩激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶G等多種蛋白酶的活性，但對凝血因子Vna(FVIIa)／組織因子(tissuefactor,TF)復(fù)合物、凝血因子Xa(FXa)、t-PA(tissue-typ

3、eplasminogenactivator)及uPA(urokinase-typevlasminogenactivator)的抑制作用不明顯。 已知TFPI的三個(gè)結(jié)構(gòu)域有其各自的功能，如結(jié)構(gòu)域1與FVIIa／TF結(jié)合并抑制其功能；結(jié)構(gòu)域2與FXa結(jié)合并抑制其功能；結(jié)構(gòu)域3與肝素、CDl4、LRP(10Wdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein，LRP)和gp330結(jié)合，發(fā)揮抗炎、協(xié)助抗

4、凝、促進(jìn)TFPI代謝等作用。從理論上推測，hTFPI-2既然與TFPI結(jié)構(gòu)類似，它的三個(gè)結(jié)構(gòu)域也應(yīng)該具有獨(dú)立的功能，但這些功能是什么則需要大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。 研究表明hTFPI-2能夠抑制乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，也能夠抑制動脈粥樣硬化斑塊的脫落。因此，hTFPI-2有可能作為一種新型蛋白質(zhì)藥物，在治療腫瘤轉(zhuǎn)移和動脈粥樣硬化并發(fā)癥方面具有潛在的應(yīng)用前景。 但是，TF

5、PI-2的生理功能迄今未知，極大地妨礙了它的應(yīng)用。由于TFPI-2是一種存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白酶抑制因子，對于細(xì)胞外基質(zhì)的重塑發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，因此人們認(rèn)為TFPI-2可能和細(xì)胞運(yùn)動、胚胎發(fā)育、傷口愈合、腫瘤轉(zhuǎn)移和動脈粥樣硬化等生理病理過程具有密切的關(guān)系。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)在模式生物中定向敲除(knockout)某個(gè)特定基因，然后觀察實(shí)驗(yàn)動物的整體結(jié)構(gòu)、功能和生理狀態(tài)的變化，已成為研究基因功能的重要方法。因此，鑒于TFPI-2的研究

6、現(xiàn)狀，有必要采用模式生物詳細(xì)研究TFPI一2的生理功能，從而對該蛋白的理論研究和應(yīng)用開發(fā)提供更多的理論知識。 我們以人胎盤組織總RNA為模板，用RT-PCR獲得hTFPI-2的cDNA基因，通過與原核表達(dá)載體重組，實(shí)現(xiàn)了hTFPI-2在大腸桿菌中的高效表達(dá)，目的蛋白以包涵體形式存在于菌體內(nèi)，表達(dá)量占全菌總蛋白的20％一30％，經(jīng)復(fù)性、純化后hTFPI-2的純度大于90％，產(chǎn)率約為20-30mg／L。性質(zhì)研究表明復(fù)性后的hTFP

7、I-2具有抑制胰蛋白酶、纖溶酶、MMP-2和MMP-9的活性，同時(shí)亦具有抑制纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080侵襲轉(zhuǎn)移的能力。 本研究還探索了采用酵母表達(dá)系統(tǒng)制備hTFPI-2第一個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域(hTFPI-2／KD)的工藝路線，并在此基礎(chǔ)上研究了hTFPI-2／KDl的功能和結(jié)構(gòu)。研究初期，我們按常規(guī)方法把hTFPI-2／KDl的野生型基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母體內(nèi)，但表達(dá)結(jié)果并不理想。在分析了hTFPI-2／KDl編碼序列的特點(diǎn)之后，

8、我們發(fā)現(xiàn)其中含有較多的酵母稀有密碼子，因此推測密碼子的偏好性可能是制約該蛋白在酵母體內(nèi)表達(dá)的原因之一。我們利用PCR的方法按照畢赤酵母密碼子使用的偏好性優(yōu)化了hTFPI-2／KDl的編碼基因，將其與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K重組，用電轉(zhuǎn)化的方法使重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母體內(nèi)，篩選出高拷貝的轉(zhuǎn)化子。種子菌經(jīng)兩次放大后，在30L發(fā)酵罐中用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)40小時(shí)后目的蛋白表達(dá)量達(dá)到高峰，并且以可溶形式存在于培養(yǎng)上清中。培養(yǎng)上清依次經(jīng)超濾、分

9、子篩、離子交換等純化步驟進(jìn)行純化。純化后的目的蛋白純度達(dá)到96％，產(chǎn)量為20mg/L左右。發(fā)色底物法檢測顯示，hTFPI-2／KDl對纖溶酶和胰蛋白酶都具有明顯的抑制作用。應(yīng)用明膠酶譜法觀察到hTFPI-2／KDl對MMP-2和MMP-9均具有抑制作用；Matrigel法觀察到hTFPI-2／KDl能夠降低纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080的體外侵襲能力。 我們聯(lián)合應(yīng)用斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫、生物信息學(xué)、RT-PCR和RACE等方法率先克

10、隆了zebrafishTFPI-2(zTFPI-2)的cDNA序列。經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)zTFPI-2同樣具有三個(gè)串聯(lián)排列的Kunitz結(jié)構(gòu)域，與人TFPI-2的三個(gè)結(jié)構(gòu)域的同源性分別為59％、65％和5l％。在此基礎(chǔ)上，我們采用斑馬魚胚胎整體原位雜交技術(shù)(wholemountmsimhybridization)觀察了zTFPI一2在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中表達(dá)的時(shí)間和空間變化，發(fā)現(xiàn)zTFPI-2在斑馬魚胚胎發(fā)育的早期階段就有明顯的表達(dá)，雜交信

11、號主要存在于胚胎的頭部和雙側(cè)胸鰭，實(shí)時(shí)定量PCR顯示zTFPI-2的表達(dá)水平在成魚各臟器中依次為腦部、心臟、肝、眼和卵巢，初步提示zTFPI-2和這些臟器的功能或發(fā)育可能有比較密切的關(guān)系。為觀察zTFPI-2在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的作用，我們根據(jù)它的基因序列設(shè)計(jì)了嗎啡琳修飾的反義核酸，采用顯微注射的方法將其注入到斑馬魚受精卵內(nèi)，使zTFPI-2的表達(dá)下調(diào)。結(jié)果顯示，zTFPI-2下調(diào)的斑馬魚胚胎出現(xiàn)頭部變小、卵黃囊增大、心包水腫、中樞神

12、經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)纖維明顯稀疏、眼底感光細(xì)胞排列紊亂等變化，同時(shí)伴有雙側(cè)胸鰭的發(fā)育顯著減緩。為了進(jìn)一步研究其中的分子機(jī)制，我們采用基因芯片比較了正常和zTFPI-2下調(diào)后的胚胎之間基因表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)zTFPI-2下調(diào)后有近六百個(gè)基因發(fā)生了兩倍以上的上調(diào)或下調(diào)。這些基因涵蓋了結(jié)構(gòu)分子、酶類、第二信使分子、轉(zhuǎn)錄因子等的編碼基因，其中與胚胎發(fā)育尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較密切的是Notch信號通路中的某些信號分子，如Notchla、mib和