Tat-Cry1Ac結(jié)構域基因表達載體構建.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，其殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，簡稱ICPs)是轉(zhuǎn)基因應用中最成功的殺蟲活性蛋白。ICPs的結(jié)構域在昆蟲的毒殺過程中起著重要的作用，然而對于ICPs各個結(jié)構域的功能及其與殺蟲活性的關系的問題，一直是學術界爭論的熱點。如何從分子生物學角度充分的解釋各結(jié)構域與功能的關系問題不論對基因的

2、改造還是遺傳重組都將起到不可估量的作用。蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構域(Protein Transduction Domain，PTD)是一類能自動穿透細胞膜，并能作為載體將其它生物大分子攜帶進入細胞膜內(nèi)的一段富含精氨酸的多肽，目前在醫(yī)學中得到了廣泛的應用。 為驗證殺蟲晶體蛋白各結(jié)構域的作用，及Tat對各結(jié)構域的影響。本實驗利用PCR的方法，合成9對引物擴增出各結(jié)構域及組合和包含Tat肽的各結(jié)構域及組合的共12個片段經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化構建的陽性克隆子

3、。經(jīng)PCR、質(zhì)粒單雙酶切、測序證明已成功構建出了pET1AcⅠ、pET1AcⅠ—Ⅱ、pET1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ、pET1AcⅡ、pET1AcⅡ—Ⅲ、pET1AcⅢ、pETT1AcⅠ、pETT1AcⅠ—Ⅱ、pETT1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ、pETT1AcⅡ、pETT1AcⅡ—Ⅲ、pETT1AcⅢ等12個融合表達載體。 構建的融合蛋白通過對IPTG誘導濃度、誘導時間、誘導溫度進行表達條件優(yōu)化，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳驗證得到：當IPTG濃度為

4、0.1mM、15℃誘導24h表達的蛋白含量最高。 在優(yōu)化的表達條件下12個融合蛋白：pET1AcⅠ、pET1AcⅠ—Ⅱ、pET1AcⅡ、pETT1AcⅠ—Ⅱ、pETT1AcⅡ—Ⅲ以可溶的形式存在。pET1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ、pET1AcⅡ—Ⅲ、pET1AcⅢ、pETT1AcⅠ、pETT1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ、pETT1AcⅡ、pETT1AcⅢ以包涵體的形式存在。 以pETT1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ為代表進行蛋白純化條件的摸索，結(jié)果得出當咪

5、唑濃度為40mM時可將靶標蛋白完全洗脫出來，并在此條件下純化出pET1AcⅠ蛋白。 對表達的粗蛋白進行生物活性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各個結(jié)構域?qū)π〔硕昃袣⑾x活性但活性普遍較低只有全長的pETT1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ較全長的pET1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ有較高的殺蟲活性，且殺蟲活性達到了92.31％；含Tat的6個結(jié)構域蛋白較不含Tat的6個結(jié)構域蛋白殺蟲活性增強，但總體殺蟲活性增加不顯著。各個結(jié)構域組合后殺蟲活性并未呈現(xiàn)疊加效應，相反殺蟲活性明顯降