組織因子途徑抑制物-2和WD重復(fù)區(qū)域62的新功能研究.pdf

1、第一部分 TFPI-2對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響和機(jī)制研究
　　組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)是一種主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的絲氨酸蛋白酶抑制物，目前尚沒有在整體水平對其生理功能和機(jī)制的研究。普遍認(rèn)為它在組織發(fā)生、傷口愈合和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等涉及到ECM重塑的生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用?，F(xiàn)有的研究也證實(shí)TFPI-2可以抑制多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，對動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脫落也具有防止作用。目前尚不明確TFPI-2的具體生理功

2、能，也未證實(shí)TFPI-2是否與大腦的發(fā)育有關(guān)。雖然人、牛、小鼠、大鼠、猿的TFPI-2基因已知，但是采用模式動(dòng)物在整體水平研究TFPI-2基因功能的研究還未見報(bào)道，TFPI-2基因敲除動(dòng)物的也未見開展。本課題應(yīng)用斑馬魚下調(diào)模型和條件性敲除小鼠模型對TFPI-2的新功能和相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了研究和探索。
　　之前，本課題組已經(jīng)克隆了斑馬魚TFPI-2(zebrafish TFPI-2，zTFPI-2)基因，包括全部編碼區(qū)和主要的5'和3'

3、非翻譯區(qū)，已提交GenBank，序列號為DQ395301。經(jīng)過序列分析，發(fā)現(xiàn)zTFPI-2同樣具有三個(gè)串聯(lián)排列的Kunitz結(jié)構(gòu)域，與人TFPI-2的三個(gè)結(jié)構(gòu)域具有相似性。通過斑馬魚胚胎整體原位雜交技術(shù)(whole mount in situ hybridization，WISH)觀察了zTFPI-2在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中表達(dá)的時(shí)間和空間變化，發(fā)現(xiàn)zTFPI-2在斑馬魚胚胎發(fā)育的早期階段就有明顯表達(dá)，雜交信號主要位于胚胎的頭部，提示zT

4、FPI-2與斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)發(fā)育可能有比較密切的關(guān)系。為了進(jìn)一步探索TFPI-2在早期胚胎發(fā)育過程中的作用，我們進(jìn)行了以下研究。
　　首先，我們應(yīng)用反義寡核苷酸和顯微注射技術(shù)建立了斑馬魚TFPI-2下調(diào)模型。首先我們設(shè)計(jì)并合成了兩種嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸(Morpholino，MO)，一種具有剪接抑制功能(KD-MO)，經(jīng)過RT-PCR和測序的方法驗(yàn)證了該MO的有效性;另

5、一種具有譯阻滯功能(TB-MO)，通過與表達(dá)TFPI-2-EGFP融合蛋白的質(zhì)粒共注射，驗(yàn)證了TB-MO的有效性。分別注射兩種MOs，斑馬魚胚胎CNS表型相似。通過不同濃度梯度注射后胚胎表型統(tǒng)計(jì)，我們選取了最適注射濃度。同時(shí)，經(jīng)過兩種MOs低濃度共注射，CNS表型更為嚴(yán)重，說明二者具有協(xié)同作用。
　　應(yīng)用顯微注射技術(shù)將兩種MOs注射到斑馬魚受精卵后，我們觀察到TFPI-2下調(diào)的斑馬魚胚胎出現(xiàn)CNS發(fā)育尤其是中后腦發(fā)育異常表型，并伴

6、有色素細(xì)胞少、體形短、活動(dòng)少和心包水腫等。這些表型在KD-MO與p53-MO共注射之后依然存在，且體外合成的TFPI-2 mRNA可以將其補(bǔ)救，說明了MOs下調(diào)該基因具有特異性。根據(jù)以上結(jié)果，我們推測TFPI-2對斑馬魚CNS發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用。而這些TFPI-2缺陷表型與文獻(xiàn)報(bào)道Notch信號通路被抑制后斑馬魚胚胎表型相似。通過基因芯片和Real-time PCR分析，發(fā)現(xiàn)TFPI-2下調(diào)后Notch信號通路信號分子her4、mib

7、和Notch1a均有不同程度的下調(diào)。有趣的是，與TFPI-2mRNA一樣，Notch通路中的信號分子her4 mRNA和mib mRNA也可以補(bǔ)救TFPI-2缺陷所致斑馬魚胚胎表型，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常表型減輕。
　　通過Real-time PCR和WISH技術(shù)，及轉(zhuǎn)基因斑馬魚的應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)zTFPI-2之后，神經(jīng)元標(biāo)志性基因HuC和前體神經(jīng)元標(biāo)志性基因ngn1表達(dá)升高，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性基因gfap和oligo2表達(dá)降低;

8、轉(zhuǎn)基因斑馬魚神經(jīng)元(HuC-GFP)陽性細(xì)胞增多而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP-GFP)陽性細(xì)胞減少。這與Notch信號通路受抑制后“旁側(cè)通路機(jī)制”被干擾結(jié)果一致，既神經(jīng)前體細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化減弱，向神經(jīng)元方向的分化加強(qiáng)。因此，我們推測Notch信號通路很可能參與了TFPI-2對斑馬魚中樞神系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控。
　　為了核實(shí)TFPI-2影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育這一新功能，進(jìn)一步探索TFPI-2通過怎樣的機(jī)制與Notch信號通路相互作用，我們

9、與上海南方模式動(dòng)物中心合作，首次建立了TFPI-2 flox小鼠模型。將TFPI-2fl/-小鼠與Nestin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，得到了在神經(jīng)干細(xì)胞定向敲除TFPI-2的條件性敲除小鼠，為進(jìn)一步研究TFPI-2生理功能和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 WDR62對斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響和機(jī)制研究
　　先天性圓錐動(dòng)脈干畸形(CTD)是一類復(fù)雜性先天性心臟病(CHD)，其發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)成為該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。我們前期

10、通過全基因組外顯子捕獲與Solexa和SOLID二代高通量測序技術(shù)，我們獲得了一批CTD新的突變基因。在查閱人類基因組數(shù)據(jù)庫UCSC基因相關(guān)信息后，通過Primer3在線軟件設(shè)計(jì)引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，我們應(yīng)用Sanger測序?qū)@些候選基因進(jìn)行擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。Mutation Surveyor軟件進(jìn)一步分析后，其中WD重復(fù)區(qū)域62(wdr62)引起了我們的關(guān)注。通過進(jìn)一步全外顯子測序分析，我們在wdr62外顯子序列發(fā)現(xiàn)了多個(gè)新突變位點(diǎn)。<

11、br>　　WDR62是一個(gè)紡錘體相關(guān)蛋白，至少含有15個(gè)WD結(jié)構(gòu)域，是WD重復(fù)蛋白家族成員之一但其具體功能尚不清楚。WD重復(fù)蛋白家族由許多結(jié)構(gòu)相似、功能不同的調(diào)控蛋白質(zhì)組成，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA轉(zhuǎn)錄和加工、蛋白運(yùn)輸?shù)冗^程，尤其在細(xì)胞分裂早期染色體修飾中具有重要的作用。已有研究表明，wdr62基因突變與常染色體隱形先天性小腦畸形(Autosomal Recessive PrimaryMicrocephaly，MCPH)相關(guān)，又被稱為MCP

12、H2。wdr62基因在腦畸形病例中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)，但至今未有該基因與先心病相關(guān)的報(bào)道。鑒于斑馬魚在CHD研究中的諸多優(yōu)點(diǎn)，本部分應(yīng)用斑馬魚模型進(jìn)一步研究wdr62在胚胎發(fā)育，尤其是心血管發(fā)育過程中的影響極其機(jī)制。
　　首先利用生物信息學(xué)的方法，我們發(fā)現(xiàn)各物種間WDR62序列具有同源性。在脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過程中，WDR62結(jié)構(gòu)和蛋白的功能結(jié)構(gòu)域上相對保守。同時(shí)，我們對wdr62基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)譜進(jìn)行了研究，RT

13、-PCR和Real-time PCR結(jié)果顯示，wdr62在斑馬魚胚胎早期(0.5～4 hpf)即有高表達(dá)，一直到成魚都持續(xù)表達(dá)。此外，wdr62在肝、心、腦、鰓和眼等多個(gè)重要器官均有表達(dá)。
　　我們設(shè)計(jì)了三個(gè)嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸:Ex2-MO、Ex8-MO和Ex26-MO。通過顯微注射MOs干擾wdr62前體mRNA的轉(zhuǎn)錄，建立了wdr62基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚模型。首先，通過RT-PCR和克隆測序，分別驗(yàn)證了三個(gè)嗎啉修飾的反義

14、寡核苷酸的有效性。其次，三個(gè)MOs與p53-MO共注射后，通過表型和凋亡分析，證實(shí)了三個(gè)反義寡核苷酸的特異性。wdr62基因表達(dá)下調(diào)后，我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎心臟出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的異常表型，包括房室變大，心臟環(huán)化不全，紅細(xì)胞嚴(yán)重減少，血細(xì)胞堆積，心臟搏動(dòng)無力且有血液回流現(xiàn)象等。與原位雜交一致，電鏡觀察結(jié)果顯示心肌纖維稀疏、分布無規(guī)則、肌小節(jié)變長。此外，wdr62基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚胚胎腦部發(fā)育也有明顯改變，出現(xiàn)了腦體積變小和腦室水腫。電鏡結(jié)果

15、顯示，腦灰質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)核糖體增加，白質(zhì)神經(jīng)纖維稀疏、減少甚至缺失。以上結(jié)果說明，在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中，WDR62是心血管和腦部正常發(fā)育所必須的。
　　為進(jìn)一步研究wdr62在斑馬魚心腦發(fā)育過程中的作用和機(jī)制，我們分析了斑馬魚胚胎的細(xì)胞增殖和凋亡情況。免疫組化結(jié)果顯示斑馬魚胚胎pH3和Ki67陽性細(xì)胞減少。而TUNEL和吖啶橙染色結(jié)果則顯示凋亡細(xì)胞增多。推測下調(diào)后斑馬魚胚胎心血管和腦發(fā)育異?？赡芘c細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控失衡相關(guān)。