組織因子途徑抑制物2誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞分化及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：①構(gòu)建表達(dá)TFPI-2的重組腺病毒（AdTFPI-2），并鑒定其在肝癌細(xì)胞Hep3B的表達(dá)水平。②AdTFPI-2感染肝癌細(xì)胞Hep3B和HepG2，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用。③應(yīng)用iTRAQ技術(shù)篩選TFPI-2作用于肝癌細(xì)胞Hep3B后的差異蛋白，在Hep3B和HepG2細(xì)胞驗(yàn)證差異蛋白。④探討TFPI-2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化的可能機(jī)制。
　　方法：⑴將pAdTrack-CMV與TFPI-2 cDNA片段經(jīng)Kpn I、X

2、ba I酶切后連接，獲得質(zhì)粒pAdTrack-CMV-TFPI-2，并測(cè)序驗(yàn)證目的基因序列的正確性。將Pme I酶切線性化的pAdTrack-CMV-TFPI-2與pAdEasy-1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組。Pac I酶切線性化的pAdTFPI-2轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝病毒，獲得AdTFPI-2，用同樣方法制備空載病毒AdGFP。AdTFPI-2感染肝癌細(xì)胞Hep3B，RT-PCR和Western blot檢測(cè)TFPI-

3、2的表達(dá)。⑵病毒感染肝癌細(xì)胞Hep3B和HepG2， RT-PCR和Western blot檢測(cè)TFPI-2的表達(dá)；Real-time PCR檢測(cè)肝細(xì)胞相關(guān)功能基因和干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)；CCK-8法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的增殖情況；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察單個(gè)肝癌細(xì)胞的增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡率和CD133+細(xì)胞。⑶病毒感染肝癌細(xì)胞Hep3B72 h時(shí)收集細(xì)胞，提取蛋白；采用iTRAQ標(biāo)記技術(shù)結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，篩選TFPI-2作用于

4、Hep3B細(xì)胞后的差異表達(dá)蛋白，同時(shí)用Protein Center軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能注釋分析；并用Western blot在Hep3B和HepG2驗(yàn)證部分差異表達(dá)蛋白。⑷AdTFPI-2感染肝癌細(xì)胞36 h后，經(jīng)siPORT NeoFX分別轉(zhuǎn)染siRNA-GSK3β和siRN-NC進(jìn)肝癌細(xì)胞，從蛋白水平評(píng)價(jià)siRNA沉默細(xì)胞內(nèi)GSK3β表達(dá)效率。qRT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞相關(guān)功能基因和干細(xì)胞相關(guān)基因表

5、達(dá)。
　　結(jié)果：①Kpn I、Xba I雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序表明，成功構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-TFPI-2；經(jīng)293A細(xì)胞包裝、擴(kuò)增獲得了高滴度的AdTFPI-2；RT-PCR以及Western blot結(jié)果表明TFPI-2在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)均明顯增強(qiáng)。②實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果表明，AdTFPI-2感染肝癌細(xì)胞后能增加APOCIII、PEPCK、ALDOB等肝細(xì)胞相關(guān)功能基因 mRNA表達(dá)；并且降低CD

6、133、β-catenin、Klf4等干細(xì)胞相關(guān)基因 mRNA表達(dá)。與對(duì)照組相比，AdTFPI-2感染肝癌細(xì)胞后增殖能力受到抑制；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明TFPI-2表達(dá)后肝癌細(xì)胞凋亡率明顯增加（Hep3B中:30.57％±1.25 VS10.19%±0.07, P<0.01; HepG2中:16.57%±0.63 VS9.24%±0.09, P<0.05），并且CD133+細(xì)胞明顯減少（Hep3B中:57.69%±2.23 VS88.4

7、6%±1.25, P<0.01; HepG2中:41.64%±1.82 VS57.39%±1.17, P<0.05）。③在Hep3B-TFPI-2組和Hep3B-GFP組，共鑒定出1536種蛋白，差異蛋白163種，其中上調(diào)蛋白96種，下調(diào)67種蛋白；差異蛋白主要分子學(xué)功能為DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活、蛋白結(jié)合、催化活性等，參與的生物學(xué)進(jìn)程為細(xì)胞交流、細(xì)胞分化、生物合成、代謝進(jìn)程、生物學(xué)調(diào)節(jié)等；運(yùn)用Western blot驗(yàn)證驗(yàn)證差異蛋白結(jié)果

8、與蛋白組學(xué)變化趨勢(shì)相同。Western blot結(jié)果顯示 Wnt/β-catenin信號(hào)通路成員β-catenin表達(dá)降低， p-GSK3β和Axin1表達(dá)升高。實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示W(wǎng)nt/β-Catenin信號(hào)通路中DKK4和Axin1 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，而β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。結(jié)果提示TFPI-2可能通過抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化。④從蛋白水平發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后

9、有效抑制siRNA-GSK3β轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后有效抑制 p-GSK3β的表達(dá)， Western blot檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染siRNA-GSK3β組的p-GSK3β蛋白相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組明顯降低（Hep3B-TFPI-2中：0.124±0.006 VS0.679±0.037, P<0.01;HepG2-TFPI-2中：0.096±0.007 VS0.732±0.009, P<0.01)。siRNA-GSK3β能抑制TFPI-2對(duì)肝癌細(xì)胞的誘導(dǎo)

10、分化作用。轉(zhuǎn)染 siRNA-GSK3β后Hep3B-TFPI-2細(xì)胞的肝細(xì)胞功能基因表達(dá)明顯下調(diào)，包括ApoCⅢ、PEPCK、ALDOB、BR、GYS2（下調(diào)比例分別為0.613±0.046、0.537±0.078、0.677±0.052、0.584±0.051和0.646±0.031）；同樣在HepG2-TFPI-2細(xì)胞中，ALDOB、HPD、APOAI、BR、GS、GYS2表達(dá)也下調(diào)（下調(diào)分別為0.537±0.013、0.449±0

11、.048、0.626±0.047、0.362±0.034、0.378±0.009和0.403±0.057）。轉(zhuǎn)染siRNA-GSK3β組和轉(zhuǎn)染siRNA-NC組比較，Hep3B-TFPI-2細(xì)胞和HepG2-TFPI-2細(xì)胞增殖明顯受到抑制（P<0.01）。
　　結(jié)論：⑴成功構(gòu)建AdTFPI-2重組腺病毒，其可高效感染肝癌細(xì)胞Hep3B和HepG2，并能在細(xì)胞內(nèi)維持TFPI-2高效表達(dá)。⑵TFPI-2可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化