應(yīng)用熒光檢測(cè)法分析AMPA受體N末端結(jié)構(gòu)域的相互作用.pdf

1、AMPA受體介導(dǎo)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)絕大部分快速型的興奮性突觸傳遞。在海馬中大部分AMPA受體是以含GluR2的異四聚體的形式存在。AMPA受體的裝配以一種“二聚化后二聚化”的模型進(jìn)行裝配。雖然在離子型谷氨酸受體的首次裝配過(guò)程中，N末端結(jié)構(gòu)域(NterminaldomainNTD)起了一定的作用，但是還不清楚在活細(xì)胞中和完整的受體中NTD的相互作用的情況。我們采用熒光檢測(cè)法包括雙分子熒光互補(bǔ)法(bimolecularfluorescencec

2、omplementationBiFC)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FluorescenceResonanceEnergyTransferFRET).來(lái)研究NTD的相互作用。BiFC是熒光蛋白在合適的位點(diǎn)打開，并標(biāo)記目標(biāo)蛋白，當(dāng)這兩片段標(biāo)記的蛋白兩兩相互作用時(shí)，熒光蛋白能正確折疊并重建熒光團(tuán)。為了方便后續(xù)的工作，我們首先構(gòu)建了胞漿型和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型(endoplasmicreticuliumER)的表達(dá)載體。在HEK293和COS7細(xì)胞內(nèi)對(duì)游離的AM

3、PA受體GluR1亞單位的NTD進(jìn)行了雙分子熒光互補(bǔ)檢測(cè)，可見黃色的熒光。證實(shí)在活細(xì)胞中，無(wú)論在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中還是在胞漿中，它們都能形成二聚體。為了排除蛋白之間非特異性的相互作用，我們選用代謝性谷氨酸受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(metabotropicglutamatereceptorligandbindingdomainmGluR1-LBD)作為陰性對(duì)照，可見微弱的非特異的相互作用.。為了檢測(cè)在完整的受體中GluR1NTD的相互作用，采用了FRE