STAT4、STAT6與CBP相互作用及其關鍵結構域的檢測.pdf

1、第一部分、STAT4、sTAT6與0BP相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與評價
　　 目的：構建STAT4、STAT6的酵母表達質(zhì)粒和CBP的誘餌表達質(zhì)粒，并檢測誘餌蛋白的毒性、滲漏和自激活作用，為酵母雙雜交檢測STAT4、STAT6與CBP的相互作用做準備。
　　 方法：PCR擴增小鼠的STAT4、STAT6和CBP基因，分別克隆入酵母雙雜交系統(tǒng)的AD和BD載體，測序正確后，將上述質(zhì)粒分別轉化酵母AH109細胞，提取細胞蛋

2、白，western blot檢測蛋白表達情況，同時檢測誘餌蛋白CBP的毒性、滲漏和自激活作用。
　　 結果：成功擴增了小鼠的STAT4、STAT6和CBP基因，并分別正確克隆入AD和BD載體，測序結果符合要求，western blot證實上述蛋白均能在AH109中正確表達，誘餌蛋白CBP對酵母AH109細胞無毒性和滲漏作用，但檢測到自激活作用。
　　 結論：成功構建了用于檢測STAT4、STAT6與CBP相互作用的酵母雙

3、雜交系統(tǒng)，但檢測到誘餌蛋白CBP有自激活作用。
　　 第二部分、誘餌蛋白CBP自激活結構域的檢測
　　 目的：將CBP蛋白的各主要結構域分別構建到誘餌表達載體pGBKT7上，分別檢測其毒性、滲漏和自激活作用來明確CBP蛋白分子中起自激活作用的關鍵結構域。
　　 方法：將CBP蛋白按主要結構域分成CBP1-697，CBP967-1574和CBP1678-2175三個部分進行PCR擴增并克隆入誘餌表達載體pGBKT7

4、，酶切和測序鑒定后將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CBP1-697、pGBKT7-CBP967-1574和pGBKT7-CBP1678-2175分別轉化酵母AH109細胞，提取細胞蛋白，western blot檢測誘餌蛋白表達情況，同時行毒性、滲漏和自激活作用檢測。將有自激活作用的CBP1-697所包含的TAZ1和KIX結構域進一步分為CBP1-436（包含TAZ1）和CBP529-1200（包含KIX）兩部分，同前進行PCR.擴增、質(zhì)粒構建、

5、轉化、蛋白表達及毒性、滲漏和自激活作用檢測。
　　 結果：成功的將CBP蛋白分子的各主要結構域分成幾個部分克隆入誘餌表達載體，使其在酵母AH109細胞中正確表達，并發(fā)現(xiàn)CBP蛋白分子的TAZ1結構域有自激活作用。
　　 結論：成功構建了可用于酵母雙雜交的CBP誘餌表達質(zhì)粒，明確了TAZ1結構域是CBP起自激活作用的關鍵結構域。
　　 第三部分、酵母雙雜交檢測STAT4、STAT6與CBP各主要結構域間的相互作用<

6、br>　　 目的：酵母雙雜交檢測STAT4、STAT6與CBP各主要結構域（TAZ1結構域除外）間的相互作用。
　　 方法：將酵母表達質(zhì)粒pGADT7-STAT4/6分別與pGBKT7-CBP529-1200、pGBKT7-CBP967-1574和pGBKT7-CBP1678-2175共轉化酵母AH109細胞，鋪相應營養(yǎng)缺陷的培養(yǎng)板，通過報告基因表達檢測篩選陽性克隆。
　　 結果：pGADT7-STAT4分別與pGBK

7、T7-CBP529-1200、pGBKT7-CBe967-1574共轉化酵母AH109細胞時不能激活報告基因表達，與pGBKT7-CBP1678-2175共轉化酵母AH109細胞后可激活報告基因表達，pGADT7-STAT6與上述任何誘餌質(zhì)粒共轉化酵母AH109細胞均不能激活報告基因表達。
　　 結論：酵母雙雜交檢測到STAT4與CBP1678-2175存在直接的相互作用，沒有檢測到STAT6與CBP各結構域（TAZ1結構域除外

8、）間的相互作用。
　　 第四部分、STAT4與CBP相互作用關鍵結構域的檢測
　　 目的：檢測STAT4蛋白分子與CBP相互作用中起關鍵作用的結構域。
　　 方法：PCR擴增N-末端結構域缺失的STAT4，并克隆入酵母表達載體pGADT7，酶切和測序鑒定后將pGADT7-STAT4-N123轉化酵母AH109細胞，提取細胞蛋白，western blot檢測融合蛋白表達情況，酵母雙雜交檢測STAT4-N123與CB

9、P1678-2175間的相互作用。
　　 結果：成功構建了不含有STAT4 N-末端結構域的酵母表達質(zhì)粒pGADT7-STAT4-N123，但pGADT7-STAT4-N123與pGBKT7-CBP1678-2175共轉化酵母AH109細胞后不能激活報告基因表達。
　　 結論：酵母雙雜交沒有檢測到STAT4-N123和CBP1678-2175存在相互作用。
　　 第五部分、免疫共沉淀對酵母雙雜交的陽性結果進行驗證

10、
　　 目的：免疫共沉淀驗證STAT4與CBP1678-2175間的相互作用，同時分別檢測STAT4、STAT6與CBP1678-2175的相互作用。
　　 方法：PCR擴增CBP1678-2175和CBP1-436并與C-Myc標簽融合，然后轉克隆入真核表達載體pIRES2-EGFP，酶切、測序鑒定后western blot檢測融合蛋白在COS7細胞中的表達情況。將pGADT7-STAT4與pIRES2-EGFP-CB

11、P1678-2175共轉染COS7細胞，提取細胞蛋白，用HA標簽抗體沉淀細胞裂解液，C-Myc標簽抗體檢測CBP1678-217S-C-Myc融合蛋白，同法檢測STAT4、STAT6與CBP1-436的相互作用。
　　 結果：成功的將CBP1678-2175和CBP1-436與C-Myc標簽融合后克隆入pIRES2-EGFP，且融合蛋白在COS7細胞中能正確表達。HA標簽抗體可將CBP1678-2175與STAT4同時沉淀，但C