ATR-TEM8 vWA結(jié)構(gòu)域與PA的相互作用.pdf

1、炭疽毒素是炭疽芽孢桿菌Bacillus anthracis的主要毒力因子，包括三個(gè)組分：保護(hù)性抗原PA，致死因子LF，水腫因子EF。目前發(fā)現(xiàn)兩種炭疽毒素受體：腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志抗原8(TEM8)和毛細(xì)血管生成蛋白2(CMG2)。這兩個(gè)受體在其胞外區(qū)都具有vWA結(jié)構(gòu)域，其中60％的序列保守。抑制PA與受體的結(jié)合可有效地阻斷炭疽毒素。炭疽病發(fā)展到晚期，在毒素大量釋放后單靠抗生素治療達(dá)不到效果，此時(shí)毒素抑制劑顯得尢為重要。受體類抑制物，比如哺乳

2、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的CMG2 vWA結(jié)構(gòu)域已被用于炭疽抗毒劑的研究。
　　 本工作通過(guò)X射線衍射解析了高分辨率(1.7A)的ATR/TEM8vWA結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示1個(gè)晶格中包括6個(gè)TEM8vWA結(jié)構(gòu)域分子。在這個(gè)六聚體中，配基結(jié)合的MIDAS序列位點(diǎn)被鄰近的單體所封閉，顯示此六聚體分子沒(méi)有活性。另外，凝膠過(guò)濾層析以及超速離心沉降實(shí)驗(yàn)表明溶液中TEM8以單體存在。這樣，觀察到的六聚體形式可能是由于晶體堆積造成的假象。
　　

3、 TEM8的晶體結(jié)構(gòu)與CMG2的vWA結(jié)構(gòu)域高度相似，同樣以經(jīng)典的α/β開(kāi)放式片層折疊結(jié)構(gòu)（又名二核苷結(jié)合折疊，或Ros smann折疊，或雙重纏繞折疊）存在。值得注意的是有一個(gè)乙酸根離子與CMG2結(jié)構(gòu)中的類似離子以同樣的方式模仿PA的D683側(cè)鏈占據(jù)MIDAS位點(diǎn)。此乙酸根離子，以及S52，S54，Tl18和兩個(gè)水分子與Mg2+進(jìn)行螯合，表明解析的TEM8具有Mg2+螯合的保守的MIDAS基序，且以開(kāi)放構(gòu)象存在，
　　 以此

4、結(jié)構(gòu)以及PA-CMG2復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB1T6B)，通過(guò)疊合和分子替換構(gòu)建了PA-TEM8復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型。經(jīng)過(guò)溶劑化和能量?jī)?yōu)化，得到了PA分別與兩種受體在溶液中的復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型。通過(guò)分析和比較，模型顯示PA與兩種受體間的相互作用在以下幾處高度保守：PA D683，N682與受體的MDAS基序S52，S54，T118的相互作用；以及受體Y119，K51與PA的相互作用。在56，88，113，115，156（按TEM8序列）處兩模型有

5、明顯的不一樣，顯示可能受體與PA的結(jié)合在這些地方有所差異。
　　 對(duì)TEM8上同源于PA-CMG2結(jié)合界面上的CMG2相關(guān)殘基進(jìn)行同源掃描替換，經(jīng)大腸桿菌表達(dá)和對(duì)可溶組分的純化，得到的突變體在J774A.1細(xì)胞上檢測(cè)了其炭疽致死毒素攻擊的保護(hù)活性。L56A突變體活性增強(qiáng)到野生型的4倍，而E155G增強(qiáng)不到一倍，L56A與E155G的聯(lián)合突變體增強(qiáng)了大概6倍的活性。與之對(duì)比，H57N，R88Q，L157V,F158P等點(diǎn)突變的保護(hù)

6、活性均有下降。用表面等離子共振技術(shù)檢測(cè)了這些突變體與PA的親和力，其變化趨勢(shì)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。
　　 同時(shí)以抗SDS的孔道復(fù)合物形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了這些突變對(duì)PA從前孔復(fù)合物至到孔道復(fù)合物進(jìn)行構(gòu)象轉(zhuǎn)變所需pH閾值的影響，所有單突變都沒(méi)有明顯的改變，而154-158的聯(lián)合突變體對(duì)比野生型顯示出了明顯的區(qū)別，接近CMG2。
　　 另外，本工作為毒素中和的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和基于受體類抑制劑的Schlid plot實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)了一個(gè)數(shù)學(xué)模型。

7、此數(shù)學(xué)模型將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與受體與PA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)關(guān)聯(lián)起來(lái)。運(yùn)用此模型評(píng)價(jià)了TEM8突變體的L56A及E155G+L56A的親和力，同時(shí)SPR的結(jié)果與此模型基本一致。
　　 最后，以大鼠模型評(píng)價(jià)了TEM8以及其突變體L56A作為抗毒劑對(duì)炭疽致死毒素的體內(nèi)中和活性。不同于前人報(bào)道，TEM8顯示出良好表現(xiàn)，在7.5:1-3:1的摩爾比（受體：PA）能完全保護(hù)動(dòng)物。而CMG2的保護(hù)活性較一致，為3:1左右。L56A能在3：1到1:

8、1之間完全保護(hù)動(dòng)物，表現(xiàn)優(yōu)于CMG2，盡管其KD及細(xì)胞上的保護(hù)活性都低與CMG2，這可能是因?yàn)樵隗w內(nèi)存在其他配基能與CMG2作用而不結(jié)合TEM8或是其突變體，這樣，CMG2作為抗毒劑就有可能導(dǎo)致副作用，此假設(shè)仍需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 在此工作中，TEM8 vWA結(jié)構(gòu)域高分辨率晶體結(jié)構(gòu)的獲得，以及溶液中兩種受體復(fù)合物模型的構(gòu)建，為進(jìn)一步的分子動(dòng)力學(xué)模擬研究溶液中構(gòu)象的轉(zhuǎn)變及分子行為以提供更多關(guān)于PA受體相互作用的細(xì)節(jié)奠定了基礎(chǔ)，而且

9、有助于蛋白設(shè)計(jì)以獲得更高親和力的受體突變體及選擇性結(jié)合TEM8以作為腫瘤靶向載體的PA突變體。同時(shí)，證明了兩種受體在56，88，155位點(diǎn)處與PA的相互作用存在差異，在56和155處的單位點(diǎn)或是聯(lián)合的同源替換突變能增強(qiáng)TEM8的結(jié)合力，而R88Q突變削弱了TEM8的親和力。這些發(fā)現(xiàn)為設(shè)計(jì)更有效的受體類抑制劑提供了研究靶點(diǎn)。進(jìn)一步的，本工作推導(dǎo)的數(shù)學(xué)模型將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與受體的解離常數(shù)KD相關(guān)聯(lián)，減少了由于不同批次間鋪板細(xì)胞數(shù)及受體表達(dá)情況