高效研究多肽結合結構域結合特性新策略的建立及其應用.pdf

1、結構域是蛋白質相互作用研究的一個簡單高效的入手點在蛋白質組學規(guī)模上研究蛋白質相互作用網(wǎng)絡是全面了解蛋白質功能、揭示疾病發(fā)病機制的有效手段之一。節(jié)點蛋白在相互作用網(wǎng)絡中占據(jù)關鍵位置，在生命調控機制中發(fā)揮重要功能，可作為研究相互作用網(wǎng)絡的一個有效突破點。很多蛋白由單個或多個結構域組成；絕大多數(shù)蛋白質相互作用是通過相互作用結構域(如PDZ，SH2，WW，SH3等)與其識別模體的結合完成的。深入研究節(jié)點蛋白的相互作用結構域，不僅可以了解詳細的相

2、互作用分子機制，為蛋白質相互作用的藥物研發(fā)提供理論基礎，而且可以在全蛋白質組水平上發(fā)現(xiàn)其所有的潛在配體蛋白，繪制以節(jié)點蛋白的相互作用為骨架的蛋白質相互作用網(wǎng)絡圖，從而系統(tǒng)地揭示蛋白質在復雜體系中的多樣功能。 本研究中，我們以最重要的蛋白質相互作用結構域之一的PDZ結構域作為入手點，建立了高效研究結構域結合特性的新策略，全面系統(tǒng)地研究了數(shù)個PDZ結構域的結合特性，發(fā)現(xiàn)了它們潛在的新配體蛋白。研究結果表明，PDZ結構域的結合特性同時

3、具有較強的規(guī)律性和一定的多樣性。由于我們研究的PDZ在多種組織和細胞結構中均有各種功能的潛在新配體被發(fā)現(xiàn)，提示PDZ蛋白在不同的體系中執(zhí)行不同的功能具有生物化學基礎，可能是一個相當普遍的現(xiàn)象。PDZ蛋白潛在的多功能性超過了我們的預期。我們猜想可能許多具有常見蛋白質相互作用結構域的蛋白也會具有超過我們以往估計的配體數(shù)量和功能多樣性。這個猜想需要更多結構域的系統(tǒng)研究方法和大規(guī)模研究才能證實。 高效研究多肽結合結構域(peptide-

4、binding domain)結合特性新策略的提出近年來常用的高通量研究結構域的方法主要有定向肽庫(oriented peptidelibrary)、SPOT合成、噬菌體展示(phage display)和酵母雙雜交(yeast two-hybrid)等。但是這些傳統(tǒng)方法都是針對某一個特定結構域所進行的大規(guī)模篩選，相對費時費力。為了適應于在蛋白質組學規(guī)模上研究結構域的結合特性、提高研究通量和效率，我們提出了一種高效地驗證性篩選目的結構域

5、結合配體文庫的新研究策略。先用目的結構域家族中有代表性的成員篩選隨機多肽文庫，收集得到的陽性克隆構建成一個配體庫，其它成員直接驗證篩選配體庫研究其識別特性。根掘驗證篩選得到的陽性和陰性結合序列推知識別規(guī)律，再以此識別規(guī)律在蛋白質數(shù)據(jù)庫中預測潛在的天然配體，最后在酵母雙雜交系統(tǒng)中驗證并發(fā)現(xiàn)新的配體蛋白。如果直接驗證篩選配體庫得到的陽性配體數(shù)量不足以得出某個結構域的識別特性，該結構域就從頭篩選隨機多肽文庫，所獲得的新陽性克隆添加到配體庫，作

6、為對配體庫的補充，可提高以后通過直接驗證篩選來研究此類PDZ的效率。另外在驗證預測的天然配體時，構建的克隆也添加到配體庫中，這也是對配體庫的重要補充，這樣直接驗證篩選就有可能找到新的配體蛋白。驗證篩選體系最大的優(yōu)點是，與傳統(tǒng)篩選相比研究效率得到了極大的提高，而且整個體系是動態(tài)發(fā)展的，配體庫會在體系的應用過程中不斷得到補充，擴充后的配體庫又會進一步提高研究效率。高效研究多肽結合結構域結合特性新策略的建立我們首先將驗證篩選的研究策略應用于P

7、DZ結構域結合特性的研究。 首先，我們收集ZO-1 PDZ1、ZO-1 PDZ3和Erbin PDZ篩選隨機多肽文庫得到的陽性克隆，構建成一個初始的配體庫。通過驗證篩選該配體庫快速研究了HtrA2 PDZ和LNX1 PDZ2的識別特性。MAGI3 PDZ4等PDZ通過驗證篩選沒有得到滿意的結果，因此從頭篩選隨機多肽文庫研究其結合特性，并將得到的陽性克隆補充到配體庫中，作為對配體庫的補充和發(fā)展。 在驗證篩選體系建立和初步發(fā)

8、展的過程中，我們對上述目的PDZ結構域的結合特性進行了詳細的分析。研究結果不僅涵蓋了以往大規(guī)模研究方法報道的結果，而且還發(fā)現(xiàn)了新的PDZ結構域識別特性，即：ZO-1 PDZ3在配體．5位偏好疏水性氨基酸，ZO-1PDZ3、LNX1 PDZ2和MAG13 PDZ4在配體的0位可選擇極性氨基酸，除MAGI3 PDZ4外的五個PDZ在配體-1位都強烈偏好芳香族氨基酸，除ZO-1 PDZ3和：MAGI3 PDZ4外的四個PDZ都可識別Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

9、三種類型的PDZ配體，HtrA2 PDZ和LNX1 PDZ2的選擇特異性都呈現(xiàn)出一定的前后氨基酸之間的連鎖關系。這些新的PDZ結合特性的揭示，為PDZ結構域的重新定義和分類提供了有價值的信息。同時，我們發(fā)現(xiàn)了以此六個目的PDZ結構域為節(jié)點的40對新的蛋白質相互作用，為深入研究這些PDZ蛋白的生物學功能提供了重要線索。 ●高效研究多肽結合結構域結合特性新策略的應用 LNX蛋白是第一個被發(fā)現(xiàn)的含有PDZ結構域的RING類型的

10、泛素連接酶E3，但是其PDZ結構域的生物學功能還不清楚。為了揭示LNX PDZ結構域的功能，我們應用已建立的高效驗證篩選體系對人類LNX家族的4個蛋白含有的9個PDZ結構域的結合特性和相互作用蛋白進行了系統(tǒng)的研究。 LNX1 PDZ1、LNX1 PDZ2、LNX1 PDZ3、LNX2 PDZ2和LNX4 PDZ通過驗證篩選和/或隨機多肽文庫篩選得到的陽性配體在C末端呈現(xiàn)明顯的規(guī)律，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)這5個PDZ結構域的結合特性有共性但也

11、有顯著的不同。同時，我們發(fā)現(xiàn)了LNX家族PDZ結構域之間的三對相互作用，即：LNX1 PDZ1和LNX1 PDZ4、LNXl PDZ1和LNX2 PDZ4、LNX2 PDZ1和LNX2 PDZ4之間的相互作用。另外，根據(jù)總結的LNXPDZ結構域的識別規(guī)律，我們在人類蛋白質組水平上發(fā)現(xiàn)了新的LNX配體蛋白。這些配體蛋白種類多樣且分布廣泛，提示LNX可能在多種復雜體系中發(fā)揮多樣的功能。 同時，在PDZ結構域高效驗證篩選體系應用的過程

12、中，我們對原PDZ配體庫又補充了新的配體，這是對配體庫的再次發(fā)展，將會使驗證篩選體系的高效性在更大規(guī)模的PDZ結構域研究中得以體現(xiàn)。 ● Liddle綜合癥分子治療的初步探索 Liddle綜合癥是一種上皮細胞鈉離子通道相關的遺傳性疾病，是1963年由Liddle等人首先發(fā)現(xiàn)的一種常染色體顯性、鹽敏感型的高血壓綜合癥。Liddle綜合癥的分子發(fā)病機制現(xiàn)已較為明確地認為是上皮鈉離子通道(epithelial Na<'+>ch

13、annel，ENaC)的β亞基或γ亞基的胞質側羧基端的PY模體低頻率的點突變或缺失突變，使其與泛素連接酶Nedd4的WW結構域之間的相互作用被打斷，導致ENaC不能正常泛素化和降解，因而在質膜上的半壽期延長、活性增加，導致鈉離子重吸收的增加，引起Liddle綜合癥。 由于Liddle綜合癥的發(fā)病機制已經(jīng)研究的比較清楚，而且僅是單基因的突變所致，這為分子治療提供了可能。我們提出了一種從分子水平上治療Liddle綜合癥的設想，即構建

14、一種可識別Liddle病人中ENaC蛋白突變的PY模體的人工泛素連接酶E3，使其結合并降解突變的ENaC蛋白，從而使質膜上ENaC的表達數(shù)量和活性恢復到正常水平。而可識別PY突變體的E3，可通過用病人中的PY突變體篩選隨機多肽庫獲得與之結合的隨機肽段，然后用其替換PY模體天然配體蛋白Nedd4中的WW結構域，從而得到一個新的人工E3。本論文中，我們以一種Liddle綜合癥突變體Y620H為誘餌蛋白，通過篩選隨機多肽文庫獲得了一個至少能與