含PH結(jié)構(gòu)域蛋白CKIP-1的亞細(xì)胞定位機(jī)制研究.pdf

1、蛋白適當(dāng)?shù)膩喖?xì)胞定位是其發(fā)揮相應(yīng)功能的前提，蛋白定位發(fā)生異常，將會(huì)對細(xì)胞功能甚至生命產(chǎn)生影響。酪蛋白激酶-2相互作用蛋白-1(casein kinase 2 interacting protein-1，CKIP-1)是一個(gè)含PH結(jié)構(gòu)域的質(zhì)膜定位蛋白?；诩?xì)胞、分子水平的研究表明，CKIP-1參與調(diào)控肌細(xì)胞分化、細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞生長，以及募集核內(nèi)的CK2和ATM激酶到質(zhì)膜等。本實(shí)驗(yàn)室最近建立了CKIP-1基因敲除小鼠模型，

2、首次從遺傳學(xué)角度發(fā)現(xiàn)其生理功能是一個(gè)新的骨形成負(fù)調(diào)控分子，機(jī)制是CKIP-1結(jié)合并增強(qiáng)特異調(diào)控成骨細(xì)胞活性的泛素連接酶Smurf1的活性。CKIP-1發(fā)揮上述功能主要依賴于其質(zhì)膜定位，但其質(zhì)膜定位機(jī)制依然不清楚，也是本論文回答的主要問題。此前的研究認(rèn)為，其PH結(jié)構(gòu)域通過與質(zhì)膜磷脂結(jié)合，決定了CKIP-1的質(zhì)膜定位。但我們的研究吃驚的發(fā)現(xiàn)，CKIP-1的PH結(jié)構(gòu)域單獨(dú)過表達(dá)，卻完全定位于細(xì)胞核。不同標(biāo)簽的PH、不同細(xì)胞系中均得到同樣的結(jié)論

3、。這提示CKIP-1的亞細(xì)胞定位機(jī)制比先前認(rèn)為的要復(fù)雜。進(jìn)而，我們鑒定了CKIP-1的PH結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個(gè)強(qiáng)的非經(jīng)典核定位信號(NLS)R82KSKSRSKK90,其中R82、K83、K89以及K90這四個(gè)堿性氨基酸為NLS功能所必需。通過系列缺失突變分析，我們發(fā)現(xiàn)CKIP-1的C末端序列(aa361-382)可通過與N端PH結(jié)構(gòu)域的相互作用抑制PH的核定位功能，這種自抑制機(jī)制參與決定了CKIP-1的質(zhì)膜定位。異源過表達(dá)CKIP-1的C端

4、截短體C-term1(aa338-409)可以募集CKIP-1顯著入核，而且存在劑量效應(yīng)關(guān)系，其機(jī)制是打破了CKIP-1的自抑制，暴露了PH的NLS，牽引CKIP-1入核。綜上，我們通過研究提出了一種新的CKIP-1質(zhì)膜定位決定機(jī)制：CKIP-1亞細(xì)胞定位是通過N端PH結(jié)構(gòu)域內(nèi)的NLS和N端-C端自抑制作用共同決定的，CKIP-1入核需要NLS介導(dǎo)，但通常情況下NLS受C端的抑制，同時(shí)PH與質(zhì)膜磷脂結(jié)合使得CKIP-1定位于質(zhì)膜；當(dāng)細(xì)胞