XA21蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位及其定位決定結(jié)構(gòu)域的鑒定.pdf

1、Xa21是一種抗水稻白葉枯病的基因，編碼一個(gè)類受體蛋白激酶，在分子生物學(xué)和遺傳育種方面具有重要的研究?jī)r(jià)值，它的蛋白產(chǎn)物XA21的亞細(xì)胞定位是整個(gè)研究體系的重要內(nèi)容。 XA21蛋白質(zhì)從C-端到N-端，主要由絲/蘇氨酸激酶區(qū)(STK)、跨膜區(qū)(TM)、富亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRR)和N-末端信號(hào)肽區(qū)(PSS)等結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，推斷認(rèn)為，跨膜區(qū)或者連同信號(hào)肽一起可能對(duì)XA21蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位起決定作用。本研究采用融合綠色熒光蛋白標(biāo)簽法，確定X

2、A21蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位并鑒定對(duì)定位起決定作用的結(jié)構(gòu)域。 本試驗(yàn)根據(jù)Xa21的序列克隆了5個(gè)目的基因片段，從大到小依次命名為，Xa21FL(完整的Xa21cDNA*克隆)、Xa212115、Xa211971、Xa211911、Xa21381，物理大小分別是3126bp、2115bp、1971bp、1911bp、381bp。它們的5'-末端都是從Xa21cDNA*的起始密碼子ATG開始、3'-末端逐次缺失那些被認(rèn)為是重要結(jié)構(gòu)域的基

3、因編碼區(qū)。所有克隆都包含有48bp的c-Myc及銜接頭序列，Xa21FL就是在原Xa21cDNA的序列中加入了c-Myc序列，因而標(biāo)記為Xa21cDNA*，二者實(shí)際上完全相同。Xa21FL采用重組PCR方法去除中間一段內(nèi)元拼接兩段外元而獲得。就上述克隆片段對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物而言，除XA21全蛋白外，其余4個(gè)蛋白質(zhì)自C-末端起逐次缺失絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)(STK)、跨膜區(qū)(TM)、富亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRR)小部分、富亮氨酸重復(fù)區(qū)絕大部分。將克隆

4、的5個(gè)目的基因片段融合在GFpS65T(Ser65用Thr替代)編碼序列的5'-端，構(gòu)建融合GFPS65T蛋白基因的表達(dá)載體，連同對(duì)照的GFPS65T蛋白基因載體pGFPS65T，通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)～48小時(shí)，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)法采集熒光圖像，進(jìn)行定位分析。由此，本試驗(yàn)得到以下結(jié)果： 1.采用重組PCR方法克隆了Xa21FL(Xa21cDNA*)；2.構(gòu)建了5個(gè)融合目標(biāo)基因片段的GFPS65T蛋白基因表

5、達(dá)載體，pXa21381-GFPS65T，pXa211911-GFPS65T，pXa211971-GFPS65T，pXa212115-GFPS65T，pXa21FL-GFPS65T； 3.熒光圖像定位分析表明，對(duì)照的熒光在整個(gè)細(xì)胞中都有分布，證明GFPS65T沒(méi)有細(xì)胞分布的特定傾向，不會(huì)對(duì)融合蛋白的定位產(chǎn)生影響；XA21融合全蛋白熒光集中在質(zhì)膜上，從而亞細(xì)胞定位XA21蛋白質(zhì)在質(zhì)膜上； 4.用反差法檢驗(yàn)相應(yīng)結(jié)構(gòu)域缺失后的