微小RNA在高血糖“代謝記憶”中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分高血糖“代謝記憶”模型的建立
　　目的：建立高血糖“代謝記憶”的動(dòng)物及細(xì)胞模型，觀(guān)察“代謝記憶”狀態(tài)下大鼠代謝指標(biāo)、NF-κB（核轉(zhuǎn)錄因子-κB）p65亞單位及前炎癥因子的表達(dá)變化。
　　方法：
　　1. Wistar大鼠分為3組：（1）正常對(duì)照組，注射檸檬酸鈉緩沖液；（2）代謝記憶組，注射鏈脲佐菌素（STZ）成模后維持高血糖水平12周，從第13周開(kāi)始皮下注射胰島素控制血糖水平在正常范圍；（3）持續(xù)高糖組，注射

2、STZ成模后維持24周高血糖狀態(tài)。
　　2.人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）分為4組：（1）正糖組，含5.5mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天；（2）滲透壓對(duì)照組，含30mM甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天；（3）代謝記憶組，含30mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)1天后，改為含5.5mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)6天；（4）高糖組，含30mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天。
　　3.采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)各組大鼠主動(dòng)脈組織及細(xì)胞樣本中p65、單核細(xì)胞趨化

3、因子-1（MCP-1）和白介素-6（IL-6）的mRNA表達(dá)水平；采用免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)p65蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.正常對(duì)照組大鼠體重持續(xù)增加，代謝記憶組及持續(xù)高糖組大鼠在注射STZ后體重增加速度均低于正常對(duì)照組；代謝記憶組大鼠體重增速高于持續(xù)高糖組，低于正常對(duì)照組。
　　2.代謝記憶組大鼠主動(dòng)脈組織及細(xì)胞樣本中p65、MCP-1及IL-6的表達(dá)水平上升。
　　結(jié)論：

4、　　1.成功建立高血糖“代謝記憶”的動(dòng)物及細(xì)胞模型。
　　2.高血糖“代謝記憶”中p65及前炎癥因子MCP-1、IL-6升高，NF-κB通路持續(xù)激活。
　　第二部分高血糖“代謝記憶”中微小RNA及其靶基因的表達(dá)變化
　　目的：分別觀(guān)察miR-146a和miR-484在高血糖“代謝記憶”狀態(tài)下的表達(dá)變化，通過(guò)生物信息學(xué)方法尋找并確定其靶基因，觀(guān)察靶基因在高血糖“代謝記憶”狀態(tài)下的表達(dá)變化。
　　方法：
　　1

5、.采用莖環(huán)熒光實(shí)時(shí)定量 PCR法檢測(cè)各組大鼠主動(dòng)脈組織及細(xì)胞樣本中miR-146a和miR-484表達(dá)水平變化。
　　2.使用生物信息學(xué)方法尋找miR-146a和miR-484可能的靶基因；檢測(cè)各組動(dòng)物及細(xì)胞樣本中靶基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.代謝記憶組大鼠主動(dòng)脈組織及細(xì)胞樣本中miR-146a的表達(dá)水平下降。
　　2.靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)到 miR-146a的靶基因包括白介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）

6、和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）；代謝記憶組動(dòng)物及細(xì)胞樣本中IRAK1、TRAF6的蛋白表達(dá)水平上升。
　　3.代謝記憶組動(dòng)物主動(dòng)脈組織及細(xì)胞樣本中miR-484的表達(dá)水平下降。
　　4.靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)到miR-484的靶基因是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B（VEGFB）；代謝記憶組動(dòng)物主動(dòng)脈組織及細(xì)胞樣本中VEGFB的表達(dá)水平上升。
　　結(jié)論：
　　1.高血糖“代謝記憶”時(shí)miR-146a表達(dá)下降，其靶基因I

7、RAK1和TRAF6表達(dá)增加。
　　2.高血糖“代謝記憶”時(shí)miR-484表達(dá)下降，其靶基因VEGFB表達(dá)增加。
　　第三部分微小RNA在高血糖“代謝記憶”中的作用機(jī)制研究
　　目的：在前述研究建立的高血糖“代謝記憶”動(dòng)物及細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染探究miR-146a和miR-484對(duì)NF-κB p65亞單位及前炎癥因子的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-146a mimics/inhi

8、bitors，上調(diào)或下調(diào)HAECs中miR-146a的表達(dá)，檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因蛋白表達(dá)水平、NF-κB p65亞單位、MCP-1及IL-6的表達(dá)水平。
　　2.通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-484 mimics/inhibitors，上調(diào)或下調(diào)HAECs中miR-484的表達(dá)水平，檢測(cè)VEGFB、NF-κB p65亞單位、MCP-1及IL-6的表達(dá)水平。
　　3.通過(guò)轉(zhuǎn)染 VEGFB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒或 VEGFB siRNA，上調(diào)或下調(diào) HAECs

9、中VEGFB的表達(dá)，檢測(cè)NF-κB p65亞單位、MCP-1及IL-6的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染miR-146a mimics后，HAECs中p65、MCP-1及IL-6的表達(dá)水平下降；轉(zhuǎn)染了miR-146a inhibitors，細(xì)胞內(nèi)p65、MCP-1及IL-6的表達(dá)水平上升。
　　2.上調(diào) miR-146a表達(dá)可使 IRAK1、TRAF6的表達(dá)水平下降；下調(diào) miR-146a表達(dá)后，IRAK1、TRA

10、F6的表達(dá)水平上升。
　　3.轉(zhuǎn)染miR-484 mimics后，HAECs中miR-484表達(dá)上升，p65、MCP-1及IL-6的表達(dá)水平下降；轉(zhuǎn)染miR-484 inhibitors，miR-484表達(dá)下降，NF-κB p65亞單位、MCP-1及IL-6的表達(dá)水平上升。
　　4.轉(zhuǎn)染 miR-484 mimics，HAECs中 VEGFB的表達(dá)水平下降；轉(zhuǎn)染 miR-484 inhibitors，VEGFB的表達(dá)水平上升

11、。
　　5.上調(diào)HAECs中VEGFB表達(dá)，NF-κB p65亞單位、MCP-1及IL-6的表達(dá)水平上升；下調(diào)VEGFB表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)p65、MCP-1及IL-6的表達(dá)水平下降。
　　結(jié)論：
　　1.高血糖“代謝記憶”時(shí)miR-146a表達(dá)下降，并可通過(guò)其靶基因IRAK1和TRAF6來(lái)調(diào)節(jié)NF-κB p65及前炎癥因子的表達(dá)。
　　2.高血糖“代謝記憶”時(shí) miR-484表達(dá)持續(xù)下降，并可通過(guò)其靶基因 VEGFB調(diào)