微小RNA-16(microRNA-16)下調(diào)表達(dá)在心肌肥厚中的作用機(jī)制研究.pdf

1、心肌肥厚是一種常見的心血管疾病,是心肌重構(gòu)中非常重要的方面,晚期的結(jié)局往往會(huì)引發(fā)心力衰竭或猝死。心肌肥厚分子機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜,現(xiàn)已證實(shí)心肌肥厚的發(fā)生與細(xì)胞周期調(diào)控,鈣信號(hào)調(diào)控等多種信號(hào)途徑相關(guān),全面揭示心肌肥厚發(fā)生的分子機(jī)制對(duì)于治療心肌肥厚尤為重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性小片段非編碼RNA,可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá),參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。多個(gè)研究證實(shí),miRNAs參與了心肌肥

2、厚的發(fā)生過程。
　　微小RNA-16(miR-16)是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。據(jù)報(bào)道,在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中miR-16表達(dá)下調(diào),恢復(fù)miR-16表達(dá)可起到抑制腫瘤的作用。miR-16是心肌組織中中等豐度表達(dá)的miRNA,其在心肌肥厚中的作用尚無報(bào)道。擬通過腹主動(dòng)脈縮窄(AAC)手術(shù),制備大鼠心肌肥厚模型,研究miR-16在發(fā)生肥厚的大鼠心肌中的表達(dá)和在心肌肥厚中的調(diào)控作用,并進(jìn)一步明確調(diào)控miR-16表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

3、>　　已有研究顯示,細(xì)胞周期素(Cyclin)在心肌肥厚時(shí)表達(dá)增強(qiáng),推動(dòng)細(xì)胞周期由G1向S期轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。我們發(fā)現(xiàn),miR-16在心肌肥厚時(shí)表達(dá)下調(diào),生物信息學(xué)分析提示,CyclinD1、CyclinD2和CyclinE1基因的3’UTR存在miR-16潛在的作用位點(diǎn)。本文提出以下科學(xué)假設(shè):miR-16下調(diào)可促進(jìn)CyclinD1、CyclinD2和CyclinE1表達(dá),推動(dòng)細(xì)胞周期由G1向S期轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。<

4、br>　　第一部分：大鼠腹主動(dòng)脈縮窄(AAC)致心肌肥厚模型的制備和鑒定
　　目的：建立因后負(fù)荷增加引起的大鼠心肌肥厚模型。方法：選用SD大鼠,體重約220g~250g,隨機(jī)分四組,即假手術(shù)組(Sham)、模型AAC1周(AAC-1w)、AAC2周(AAC-2w)、AAC3周(AAC-3w),每組8只。模型組采用0.3mm的動(dòng)脈銀夾縮窄大鼠的腹主動(dòng)脈,假手術(shù)組只分離腹主動(dòng)脈,不造成縮窄。利用小動(dòng)物B超檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)和功能。通過心肌切

5、片的HE染色,觀察心臟形態(tài)變化。通過熒光定量PCR檢測(cè)肥厚早期標(biāo)志性基因心房利尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)的mRNA表達(dá)水平。采用Westernblot方法檢測(cè)ANP和β-MHC的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：AAC模型組較假手術(shù)組大鼠的心臟體積變大,左心室/脛骨長(zhǎng)度比顯著增加;在AAC-2w和AAC-3w組的大鼠,心室前后壁增大,左室間隔半徑縮短;左心室短軸縮短指數(shù)(FS％)和左心室射血分?jǐn)?shù)(EF%)均顯著降低。ANP、β-M

6、HC的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高。結(jié)論：采用腹主動(dòng)脈狹窄法成功建立了由壓力后負(fù)荷增加引起的大鼠心肌肥厚模型。
　　第二部分：miR-16在心肌肥厚中的表達(dá)變化
　　目的：明確大鼠心肌肥厚時(shí)miR-16的表達(dá)變化。方法：采用熒光定量PCR,檢測(cè)大鼠肥厚心肌中miR-16的宿主基因SMC4、miR-16前體及miR-16成熟體水平。采用原代分離培養(yǎng)乳大鼠心肌細(xì)胞,經(jīng)苯腎上腺素(PE)處理后,檢測(cè)ANP、β-MHC、SMC4

7、、miR-16前體及miR-16成熟體表達(dá)。結(jié)果：成功建立PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大模型,心肌細(xì)胞表面積增大,細(xì)胞RNA合成增加,ANPmRNA表達(dá)顯著上調(diào)。在整體心肌肥厚模型和肥大心肌細(xì)胞中,一致性地證實(shí)SMC4、miR-16前體及miR-16成熟體表達(dá)降低。結(jié)論：在整體和細(xì)胞水平上證實(shí),miR-16在大鼠心肌肥厚時(shí)下調(diào)表達(dá)。
　　第三部分：miR-16對(duì)心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用
　　目的：觀察miR-16表達(dá)對(duì)心肌肥大表型

8、的影響。方法：原代分離乳大鼠心肌細(xì)胞,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Negative Control(NC)、miR-16mimics、miR-16inhibitor,利用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)ANPmRNA和蛋白表達(dá),利用FITC-鬼筆環(huán)肽染色顯示心肌細(xì)胞中Factin表達(dá),EU染色顯示新合成RNA,用激光共聚焦顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài),利用IPP軟件測(cè)量細(xì)胞表面積。結(jié)果：與轉(zhuǎn)染NC組相比,miR-16 mimics可抑制PE誘導(dǎo)

9、的心肌細(xì)胞中ANP表達(dá)上調(diào),以及心肌細(xì)胞表面積和新合成RNA的增加。與感染rAd-GFP對(duì)照病毒相比,感染重組miR-16病毒(rAd-miR-16)可顯著抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中ANP表達(dá)升高,以及心肌細(xì)胞表面積和新合成RNA的增加。而轉(zhuǎn)染miR-16 inhibitor可引起乳大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大表型。結(jié)論：miR-16參與調(diào)控了心肌細(xì)胞肥大過程。
　　第四部分：介導(dǎo)miR-16調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的靶基因鑒定
　　目的：鑒

10、定介導(dǎo)miR-16調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的靶基因。利用Target Scan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-16作用的靶基因。熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)miR-16靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。FITC-鬼筆環(huán)肽染色顯示心肌細(xì)胞表面積。結(jié)果：miR-16可靶向作用三個(gè)與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的CCND1、CCND2、CCNE1基因,在發(fā)生肥厚的大鼠心肌組織和PE誘導(dǎo)肥大的大鼠心肌細(xì)胞中,上述細(xì)胞周期蛋白表達(dá)升高,過表達(dá)miR-16的

11、可降低心肌細(xì)胞中CCND1、CCND2和CCNE1的蛋白水平,但對(duì)它們的mRNA水平?jīng)]影響。分別沉默CCND1、CCND2、CCNE1表達(dá)可顯著抑制PE引起的心肌細(xì)胞肥大表型。結(jié)論：CCND1、CCND2、CCNE1介導(dǎo)了miR-16對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抑制作用。
　　第五部分：調(diào)控心肌肥厚時(shí)miR-16表達(dá)的信號(hào)通路研究
　　目的：探討Stat3/c-Myc信號(hào)通路在調(diào)控miR-16下調(diào)表達(dá)中的作用。方法：采用Western

12、blot方法檢測(cè)肥厚的大鼠心肌組織及PE誘導(dǎo)肥大的大鼠心肌細(xì)胞中p-Stat3、Stat3、p-c-Myc、c-Myc蛋白水平。分別利用相應(yīng)的Stat3、c-Myc抑制劑處理大鼠心肌細(xì)胞,通過熒光定量PCR檢測(cè)miR-16成熟體的表達(dá)水平。結(jié)果：p-Stat3、p-c-Myc蛋白水平在AAC誘導(dǎo)肥厚的大鼠心肌組織和PE處理的乳大鼠心肌細(xì)胞中顯著上調(diào);p-Stat3、p-c-Myc的抑制劑均能明顯升高大鼠心肌細(xì)胞中miR-16表達(dá)。結(jié)論：

13、心肌肥厚時(shí)Stat3/c-Myc信號(hào)通路激活,并負(fù)調(diào)控了心肌中miR-16的表達(dá)。
　　全文總結(jié):本文在心肌組織和細(xì)胞水平上證實(shí),心肌肥厚時(shí)miR-16成熟體、miR-16前體及宿主基因SMC4表達(dá)降低。增加miR-16表達(dá)可抑制PE引起的心肌細(xì)胞肥大表型,而抑制miR-16表達(dá)就可引起心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大表型。熒光定量PCR和Western blot結(jié)果證實(shí),miR-16可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控CCND1、CCND2和CCNE1的表達(dá)。在