MicroRNA-16調(diào)控BCL2表達(dá)和NF-κB1_MMP-9信號通路抑制膠質(zhì)瘤生長和侵襲的機(jī)制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是成人原發(fā)性腦腫瘤中最常見的類型之一,并且也是最具侵襲性和致死性的人類癌癥類型之一。在過去的幾十年中,越來越多的證據(jù)已經(jīng)表明,微小 RNA(miRNAs),一類非編碼 RNA,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MicroRNA通過對靶向 mRNA的降解和翻譯水平的調(diào)控,從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著原癌基因和抑癌基因的作用。通過對microRNA.org數(shù)據(jù)庫和miR Walk數(shù)據(jù)庫的分析,我們預(yù)測miR-16與人腦膠質(zhì)瘤有著密切的關(guān)系。已

2、有研究表明,miR-16在多種顱外惡性腫瘤如前列腺癌、乳腺癌、肺癌以及慢性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)異常減少,提示 miR-16是具有抑癌作用的一類miRNA。
　　人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤的高度侵襲性是目前臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一個主要障礙。在分子水平上,腫瘤細(xì)胞侵襲與腫瘤細(xì)胞激活或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動,基質(zhì)的破壞,血管生成和其它生物事件密切相關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn) NF-κB介導(dǎo)了細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和血管生成,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中存在異常激活,是腫瘤侵襲性的

3、關(guān)鍵因素。P50作為NF-κB活化的核定位指標(biāo),在多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的臨床標(biāo)本也被檢測到。NF-κB信號傳導(dǎo)通路通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期,和侵襲過程中的多種靶基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在NF-κB調(diào)節(jié)的所有基因中,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與腫瘤的侵襲密切相關(guān)。在所有的基質(zhì)金屬蛋白酶,基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)的水平隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤惡性程度增而增加,因此被稱為侵襲的關(guān)鍵酶。通過

4、microRNA.org數(shù)據(jù)庫分析miR-16和NF-κB1 mRNA序列之間的同源性,我們發(fā)現(xiàn)15個核苷酸完全互補(bǔ)配對。因此,我們推測miR-16可能抑制NF-κB1和MMps蛋白質(zhì)的表達(dá),從而可能抑制或降低了神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲能力。BCL2是一種致癌基因,其存在于線粒體中具有抗凋亡蛋白的作用,并且還與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展有著密切關(guān)系。
　　在本研究中我們不僅要探討miR-16在非瘤腦組織、不同級別的人腦膠質(zhì)瘤組織以及三個惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系

5、(SHG44, U87 and U373)中的表達(dá),以及miR-16和NF-κB1在同一人腦膠質(zhì)瘤組織之間的表達(dá)的相關(guān)性,而且進(jìn)一步通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)探討miR-16與人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和侵襲性的相關(guān)性,為進(jìn)一步深入研究miR-16在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　一、材料和方法
　　1.通過對microRNA.org數(shù)據(jù)庫和miR Walk數(shù)據(jù)庫的分析,我們認(rèn)為miRNA16(miR-16)與人腦膠質(zhì)瘤和其他大多

6、數(shù)人類腫瘤有著密切的關(guān)系。
　　2.通過 Lipofectamine2000脂質(zhì)體法將化學(xué)合成 miR-16寡核苷酸隨機(jī)序列轉(zhuǎn)染到惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44 U87和U373中。為了實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)的miR-16,本研究通過Lipofectamine2000脂質(zhì)體法在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中轉(zhuǎn)染包含穩(wěn)定表達(dá)pre-miR-16有寡核苷酸序列的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR質(zhì)粒。
　　3.通過流式細(xì)胞儀和綠色熒光觀

7、察從而檢測人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44、U87和U373的轉(zhuǎn)染率。通過實(shí)時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測miR-16和NF-κB1在非瘤腦組織和人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)。
　　4.在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44、U87和 U373通過轉(zhuǎn)染miR-16 mimics、miR-16 inhibitor和 negative control oligonucleotide序列后,通過 Annexin V PE Apoptosis

8、 Detection Kit PE和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的早期凋亡率。通過劃痕試驗(yàn)以及Transwell試驗(yàn)檢測miR-16對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44、U87和 U373侵襲能力的影響。
　　5.通過Western blot.檢測NF-κB1、BCL2、MMP2和 MMP9蛋白的表達(dá)。
　　6.為了進(jìn)一步在體內(nèi)觀察miR-16對膠質(zhì)瘤侵襲和生長的影響,我們分別構(gòu)建了過表達(dá)miR-16的U87細(xì)胞的顱內(nèi)和皮下模型。HE染色和免疫

9、熒光被用來檢測miR-16在顱內(nèi)標(biāo)本中的侵襲能力。通過免疫組化檢測 miR-16、NF-κB1、MMP9和 Ki-67的表達(dá)。通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NF-κB1和Bcl2為miR-16直接作用靶點(diǎn)。
　　7.應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,凋亡和侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果采用單因素方差分析,兩組皮下裸鼠腫瘤體積的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05
　　二、結(jié)果
　　1.在人腦膠質(zhì)瘤中miR-16與 NF-κ

10、B1表達(dá)呈反相性相關(guān)。
　　實(shí)時熒光定量PCR檢測6例非瘤腦組織和29例人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 miR-16在原發(fā)人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)明顯低于非瘤腦組織(P<0.01),并且隨著腫瘤惡性程度的不斷增加miR-16表達(dá)逐漸降低,低級別膠質(zhì)瘤(Ⅰ,Ⅱ)與高級別膠質(zhì)瘤(Ⅲ,Ⅳ)相比p<0.05;然而,隨著人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性程度的增加NF-κB1表達(dá)卻逐漸升高,低級別膠質(zhì)瘤(Ⅰ,Ⅱ)與高級別膠質(zhì)瘤(Ⅲ,Ⅳ)相比

11、p<0.01,因此,在同一人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中檢測發(fā)現(xiàn) NF-κB1的mRNA表達(dá)與miR-16表達(dá)呈反向關(guān)系。
　　2.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-16直接靶向調(diào)控NF-κB1的表達(dá)。
　　通過microRNA.org數(shù)據(jù)分析miR-16和NF-κB1 mRNA序列之間的同源性,發(fā)現(xiàn)15個核苷酸完全互補(bǔ)配對。通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測證實(shí)miR-16直接靶向調(diào)控NF-κB1的3’UTR區(qū)域。應(yīng)用qRT-PCR和 Western blott

12、ings實(shí)驗(yàn)檢測NF-κB1 mRNA和蛋白表達(dá),數(shù)據(jù)顯示 miR-16過表達(dá)明顯減少 NF-κB1mRNA和蛋白的表達(dá);同時下調(diào)miR-16的表達(dá),NF-κB1表達(dá)增加。
　　3. miR-16直接抑制了Bcl2蛋白表達(dá),從而誘導(dǎo)了人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞早期凋亡。
　　通過microRNA.org數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)BCL2可能為miR-16的天然靶基因。本研究采用實(shí)時定量PCR檢測miR-16的表達(dá),同時采用Western blott

13、ing檢測 BCL2的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同一人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中miR-16與BCL2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)miR-16明顯抑制BCL2的3’UTR(p<0.05)。通過流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),增加miR-16的表達(dá)能夠誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞的比例顯著升高(P<0.01, n=3)。通過體外實(shí)驗(yàn),對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U373和SHG44細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-16 mimics和inhibitors,通過Wes

14、tern blotting檢測 BCL2的表達(dá),其結(jié)果顯示miR-16的過表達(dá)明顯導(dǎo)致Bcl2蛋白表達(dá)的降低。
　　4.在體外實(shí)驗(yàn)中miR-16的過表達(dá)明顯降低了人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。
　　在本研究中,我們采用了劃痕試驗(yàn)和 Transwell試驗(yàn),其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)mir-16后,人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44,U373和U87細(xì)胞的侵襲能力明顯降低(p<0.01)。
　　5.在體外實(shí)驗(yàn)中miR-16的過表達(dá)明顯降低了

15、MMP9的表達(dá)。
　　通過Western blottings檢測侵襲相關(guān)基因MMP9和MMP2蛋白水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中 miR-16過表達(dá)能夠明顯降低 MMP9蛋白的表達(dá),然而對MMP2蛋白的表達(dá)影響不明顯。
　　6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-16通過NF-κB1的靶向調(diào)節(jié)從而顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤的生長,增殖和侵襲。
　　通過人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤的裸鼠顱內(nèi)和皮下模型發(fā)現(xiàn):在顱內(nèi)腫瘤中,HE染色顯示與陰性組相比

16、,陽性組腫瘤邊界明顯,腫瘤體積明顯較小;與陰性對照組相比,所有陽性組皮下腫瘤的生長受到明顯抑制。免疫熒光顯示miR-16降低了MMP9的表達(dá)并且抑制了膠質(zhì)瘤的侵襲;免疫組化檢測發(fā)現(xiàn) miR-16明顯抑制了NF-κB1,MMP9和 Ki-67的表達(dá),其中陰性組 Ki-67增殖指數(shù)為32.98％,陽性組 Ki-67增殖指數(shù)為13.91％。
　　三、結(jié)論
　　在本研究中我們通過在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-16作為腫瘤發(fā)生、發(fā)展負(fù)

17、面調(diào)節(jié)器,進(jìn)而調(diào)節(jié)了膠質(zhì)瘤的生長和侵襲;在人腦膠質(zhì)瘤中miR-16在原發(fā)人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)明顯低于非瘤腦組織,并且隨著腫瘤惡性程度的不斷增加miR-16表達(dá)逐漸降低,在同一人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中miR-16與 NF-κB1表達(dá)呈反相性相關(guān)。在本研究中,我們證明了miR-16作為一個抑癌基因,通過調(diào)控 BCL2表達(dá)和NF-kappaB1/MMP-9信號通路,從而抑制了人腦膠質(zhì)瘤的生長和侵襲。本研究不僅為探索miR-16在人腦